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柠檬酸是一种重要的有机酸,广泛应用于食品、医药、化工等领域。柠檬酸工业生产的主力菌种使用严格的好氧微生物黑曲霉,其发酵过程对氧需求非常高,短暂低氧会对柠檬酸生产造成不可逆损伤,因而溶氧控制是黑曲霉柠檬酸发酵过程控制的重要因素。专性好氧的革兰氏阴性细菌透明颤菌在低氧条件下诱导表达透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb),使其得以在贫氧环境中生长。已有报道在异源好氧微生物中利用透明颤菌血红蛋白结合氧的特性,增强细胞对氧的利用能力,提高目标产物的产量和收率。本论文拟探索透明颤菌血红蛋白在柠檬酸高产黑曲霉工业菌株中的过表达及其对柠檬酸发酵的影响。本论文首先实现了透明颤菌血红蛋白编码基因vgb在Escherichiacoli BL21(DE3)中的诱导表达,并利用CO差异光谱检测证实该基因具有氧结合活性。随后构建了透明颤菌血红蛋白的黑曲霉表达载体,启动子采用黑曲霉糖化酶启动子PglaA;本文细致地优化了黑曲霉柠檬酸工业菌株的基于PEG介导的原生质体转化方法,并成功将VHb表达载体整合至基因组上。通过多次菌株分纯与基因组PCR检测,获得了透明颤菌血红蛋白过表达工业黑曲霉菌株。利用Western-blot与CO差异光谱检测,证实了透明颤菌血红蛋白在柠檬酸工业黑曲霉菌株中实现活性表达。然后考察了不同溶氧条件下透明颤菌血红蛋白的过表达对黑曲霉柠檬酸发酵的影响。在溶氧充足条件下,透明颤菌血红蛋白使柠檬酸的产量与黑曲霉菌株糖酸转化率分别提高7.75%;7.94%,增强了菌株柠檬酸产酸性能;当溶氧浓度降低时,透明颤菌血红蛋白在一定程度上可以缓解低氧对菌株造成的影响;同时在发酵罐水平短暂断氧条件下,透明颤菌血红蛋白使柠檬酸的积累量提升约6%,但当溶氧严重不足或断氧时间过长时,实验组柠檬酸产量及转化率均降低,说明现有体系中透明颤菌血红蛋白还不足以缓解极低氧环境对柠檬酸发酵造成的损伤,推测可能是由于过量表达VHb占据细胞资源并分流部分碳源造成的。本论文优化了黑曲霉柠檬酸工业生产菌株的原生质体转化方法,为工业菌株的分子生物学研究和菌株遗传改造奠定了基础。同时针对过表达透明颤菌血红蛋白对黑曲霉柠檬酸发酵的影响进行了有益探索,继续优化透明颤菌血红蛋白过表达水平,有望提高工业菌株在低氧或断氧等不利条件下的生产稳定性。