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目的酒精能够促进丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)在肝细胞中复制,但机制尚未完全阐明。我们前期研究发现酒精可以上调激活的STAT抑制蛋白y(protein inhibitor of activated STATy,PIASy)在肝细胞表达,本研究对其在诱导细胞自噬及对HCV复制的影响和涉及的具体机制开展研究,以期发现酒精促进HCV复制的新机制。方法本研究利用肝癌细胞系—Huh7细胞(支持HCV JFH-1复制),采用体外研究的方法开展研究。首先,用不同浓度的酒精处理HCV感染的Huh7细胞,采用实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和免疫印迹法(Western Blot,WB)分别在基因及蛋白水平检测HCV RNA和HCV core蛋白的表达水平,探讨酒精对HCV复制的影响。其次,在酒精处理的条件下,分别在m RNA及蛋白水平检测PIASy m RNA及PIASy蛋白的表达,验证酒精是否上调PIASy的表达;并在酒精处理的条件下,Huh7细胞过表达或敲降PIASy,用WB检测HCV core蛋白,分析PIASy的表达对酒精促进HCV复制的影响。再次,在酒精处理的条件下,检测LC3 m RNA水平和LC3B-I、LC3B-II、p62蛋白水平的表达,利用含GFP-LC3慢病毒转染Huh7细胞,采取免疫荧光检测GFP-LC3点状聚集,分析酒精对细胞自噬的影响,并利用自噬体-溶酶体融合抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)处理,分别用WB及免疫荧光显微镜观察LC3B-I、LC3B-II蛋白的表达和GFP-LC3点状聚集情况,分析酒精处理对细胞自噬流的影响,进一步过表达或敲降PIASy表达,检测LC3B-I、LC3B-II、p62蛋白水平的变化,分析PIASy的表达对酒精诱导细胞自噬的影响;此外,用自噬早期抑制剂3-甲基腺苷(3-methyladenine,3-MA)处理过表达或敲降PIASy表达的感染HCV的Huh7细胞,WB检测LC3B-I、LC3B-II、HCV core蛋白的表达水平,观察3-MA抑制PIASy促进自噬的作用及其对HCV复制的影响;最后,在Huh7细胞过表达或敲降PIASy表达条件下,CQ处理细胞,用WB和免疫荧光显微镜检测LC3B-I、LC3B-II蛋白水平和GFP-LC3点状聚集,观察PIASy对自噬流的影响;分别用SUMO 1及SUMO 2/3抗体及自噬相关因子抗体检测PIASy表达对蛋白SUMO化修饰和自噬相关因子表达的影响,分析PIASy诱导Huh7细胞自噬的潜在机制。结果1.酒精促进HCV在Huh7细胞中复制。用不同浓度的酒精、采用不同时间处理HCV感染的Huh7细胞,Huh7细胞中HCV RNA及HCV core蛋白表达水平显著上调,并且呈浓度及时间依赖趋势(p<0.05)。表明酒精促进HCV复制。2.酒精通过上调PIASy表达促进HCV在Huh7细胞中的复制。(1)酒精上调Huh7细胞PIASy的表达用不同浓度的酒精、采用不同时间处理Huh7细胞,Huh7细胞内PIASy m RNA水平及PIASy蛋白水平的表达显著上调,并且呈浓度及时间依赖趋势(p<0.05),酒精对PIAS家族其他蛋白的表达水平无显著影响(p>0.05)表明酒精只特异性促进PIASy表达。(2)酒精通过上调PIASy表达促进HCV的复制。采用过表达和敲降PIASy表达研究PIASy在酒精促进HCV复制中的作用。过表达PIASy上调HCV core蛋白水平(p<0.05);并且过表达PIASy显著增强酒精上调HCV core蛋白水平(p<0.05)。敲降PIASy表达则显著下调HCV core蛋白水平(p<0.05),同时敲降PIASy表达下调了酒精处理条件下的HCV core蛋白水平(p<0.05)。3.酒精通过上调PIASy表达诱导Huh7细胞的细胞自噬(1)酒精处理诱导Huh7细胞的自噬。用不同浓度的酒精、采用不同时间处理Huh7细胞,酒精对Huh7细胞LC3 m RNA的表达水平无显著影响(p>0.05),但是显著上调了LC3B-II蛋白水平,并促进LC3B-I向LC3B-II转化(LC3B-II/LC3B-I)及下调p62的蛋白水平(p<0.05);同时,在免疫荧光显微镜下观察到在酒精处理条件下,围绕在细胞核周围的GFP-LC3点状聚集明显增多(p<0.05)。表明酒精诱导Huh7细胞产生细胞自噬。在酒精处理的条件下,再用氯喹(Chloroquine,CQ;细胞自噬体-溶酶体融合抑制剂)处理,氯喹能上调LC3B-II水平(p<0.05),在免疫荧光显微镜下观察到氯喹及酒精共处理组GFP-LC3点状聚集显著高于氯喹或酒精单独处理组(p<0.05)。(2)酒精通过上调PIASy表达诱导Huh7细胞自噬在PIASy过表达条件下,PIASy过表达或酒精处理都能上调LC3B-II的蛋白表达水平、促进LC3B-I向LC3B-II转换及下调P62的表达(p<0.05);过表达PIASy显著增强酒精上调LC3B-II的蛋白表达水平、促进LC3B-I向LC3B-II转换及下调P62的表达的作用。而敲降PIASy表达,细胞内的LC3BII蛋白表达水平下调、LC3B-I向LC3B-II转换水平下降,及P62的表达水平上调(p<0.05);同时,酒精上调的LC3B-II的蛋白表达水平、LC3转换(LC3B-II/LC3B-I)及下调P62的表达的作用被抑制(p<0.05)。4.PIASy诱导细胞自噬促进HCV的复制。在过表达或敲降PIASy表达的条件下,3-甲基腺苷(3-MA,细胞自噬早期抑制剂)能显著抑制PIASy过表达组中LC3B-II蛋白表达水平的上调、LC3B-I转换LC3B-II水平的升高,及P62蛋白表达水平的下调(p<0.05),并下调HCV core蛋白的表达水平(p<0.05);3-MA处理可显著增强敲降PIASy表达引起的HCV core蛋白水平下调(p<0.05)。5.PIASy通过促进SUMO 1介导的蛋白修饰诱导细胞自噬(1)PIASy对细胞自噬流的影响在CQ处理的条件下,过表达PIASy进一步提高CQ诱导的LC3B-II蛋白表达水平、LC3B-I向LC3B-II转换(LC3B-II/LC3B-I)水平(p<0.05)。并且,GFP-LC3点状聚集显著增多(p<0.05);敲降PIASy表达,降低CQ引起的LC3B-II的蛋白堆积水平(p<0.05);同时,CQ诱导的GFP-LC3点状聚集显著减少(p<0.05)。(2)PIASy通过促进SUMO 1介导的蛋白修饰诱导细胞自噬。在过表达或敲降PIASy表达的条件下,分别用SUMO1和SUMO2/3抗体检测SUMO化修饰蛋白水平。过表达PIASy能显著促进SUMO1介导的SUMO化修饰蛋白水平(p<0.05),对SUMO2/3介导的SUMO化蛋白修饰水平无显著影响(p>0.05);敲降PIASy表达,SUMO1介导的蛋白修饰水平明显降低(p<0.05),而SUMO2/3介导的SUMO化蛋白修饰水平无显著影响(p>0.05)。同时,PIASy过表达上调自噬相关因子ATG5-12复合体和ATG7的表达(p<0.05),敲降PIASy表达则下调了ATG5-12和ATG7表达(p<0.05)。结论上述结果表明酒精通过上调PIASy的表达来诱导Huh 7细胞产生细胞自噬,进而促进HCV复制,同时,PIASy可能通过促进SUMO 1介导的SUMO化蛋白修饰诱导自噬作用。本研究为酒精促进HCV复制机制提出了一种新的解释。