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肺癌是全球最常见的恶性肿瘤,也是癌症相关的主要死亡原因,它对人类健康和生命造成了巨大的威胁。传统的外科手术、化疗药物和放射治疗已经使肺癌的疗效陷入瓶颈。分子遗传学认为非小细胞肺癌是一类不同分子亚型构成的异质性疾病,不同亚型相应的靶向药物改善无数肺癌患者的生存和预后。近年来发现PI3K/AKT信号转导通路与非小细胞肺癌密切相关,在肿瘤细胞生长增殖,侵袭转移和化放疗耐药等方面起重要作用。以PI3K为靶点的药物研发越来越受到重视,针对其抑制剂的开发是新药研发的热点。应用计算机辅助筛选技术研究FDA已经批准应用于临床的药物,可以富集活性化合物,降低成本和节约时间,发现这些药物新的适应症。本课题选取PI3K作为靶蛋白,idock软件模拟蛋白-配体对接分子作用,从FDA批准的药物数据库筛选出能与PI3K蛋白分子成功对接的药物,采用MTT初步检测这些计算机筛选的PI3K抑制剂对肺癌细胞的抑制作用。体外细胞实验(Western blotting和流式细胞技术)和体内动物实验(裸鼠移植瘤)进一步验证新型的PI3K抑制剂对肺癌的抑制作用,探讨其抗癌机制以及PI3K抑制剂与化疗药物联用的抑制作用。本课题通过计算机筛选和生物学实验证实新型的PI3K抑制剂能够有效抑制PI3K/AKT信号通路,阻滞肺癌细胞的生长增殖,促进凋亡,并与化疗联用有增效的作用。这种新型的PI3K抑制剂可能成为治疗肺癌的小分子靶向药物,实现其老药新用的价值,为肺癌靶向药物的研发及治疗方案的优化奠定理论基础。我们通过对PI3K抑制剂研究为我国抗肿瘤药物的筛选和新药发现提供新的方向。[目的]通过计算机筛选和生物学实验的方法验证新型的PI3K抑制剂能够抑制肺癌细胞的生长增殖,对PI3K/AKT信号通路有阻断作用,新型的PI3K抑制剂与化疗药物联用有增效的作用,并探讨其抗癌的作用机制。[方法](1)以PI3Kα作为靶蛋白,应用计算机idock软件模拟蛋白-配体对接分子作用,发现PI3K的候选抑制剂。(2)MTT检测筛选出的PI3K抑制剂对肺癌细胞活性的抑制作用,发现新型的PI3K抑制剂。与对照组和肺正常上皮细胞株相比,用不同浓度的PI3K抑制剂分别处理不同病理亚型的肺癌细胞株,MTT检测其对肺癌细胞活性的影响。(3)应用免疫印迹(Western blotting)方法检测PI3K抑制剂处理后的肺癌细胞蛋白水平的表达。包括PI3K和AKT蛋白的表达变化以及对其下游蛋白VEGF,Bcl-2和MMP-9等的作用,同时检测对其他通路的蛋白ERK是否有抑制作用。(4)应用流式细胞技术检测PI3K抑制剂对肺癌细胞凋亡和坏死的影响。Western blotting检测其对凋亡相关蛋白(PARP和Caspase-3)的作用。(5)在裸鼠体内进行荷瘤实验,检测PI3K抑制剂是否可以抑制肺癌移植瘤在动物体内的生长。裸鼠腹腔注射PI3K抑制剂对移植瘤的抑制作用及其毒副作用。(6)MTT,Western blotting和流式细胞技术检测PI3K抑制剂与化疗药物顺铂联合应用是否能够有协同增效的作用。[结果](1)药物数据库由3167种已被FDA批准临床使用的药物组成。利用开放的网络平台软件idock对3167个化合物配对ATP结合位点的PI3K进行运算,对接的可视结果在 http://istar.cse.cuhk.edu.hk/idock/iview/?4JPS-dbap+fda+npc 获得。筛选到的8个化合物分别为:硝酸益康唑(Econazole nitrate)、盐酸氟哌噻吨(Fupentixol dihydrochloride)、依泽替米贝(Ezetimibe)、甲磺酸多沙唑嗪(Doxazosin mesylate)、咪唑司汀(Mizolastine)、他尼氟酯(Talniflumate)、爱维莫潘(Alvimopan)和阿哌沙班(Apixaban)。idock的评分在-7.3～-8.97 kcal/mol之间,RF的评分在7.07～7.67 pKd之间。(2)对计算机筛选的8个化合物进行MTT检测,结果显示5个化合物对肺癌细胞株(H661和A549)有抑制作用,3个化合物没有抑制作用。其中硝酸益康唑的抑制作用最强。用不同浓度梯度的硝酸益康唑(Econazole)处理肺癌各种亚型细胞均有明显的抑制作用(肺大细胞肺癌H661 IC50=5.98 μM,肺腺癌A549 IC50=6.456μM,肺鳞癌 SK-SEM-1 IC50=22.2μM,肺鳞癌 NCI-H520 IC50=22.3μM),硝酸益康唑对各个肺癌细胞株的抑制作用随药物浓度的增加而逐渐增强,呈现良好的浓度依赖关系。硝酸益康唑在不同时间点(24h,36h,48h,72h)作用H661细胞株,24小时抑制作用最强。与已知的PI3K选择性抑制剂BLY719(IC50=45.9μM)和泛 PI3 K 抑制剂 BKM120(IC50=63.9 μM)相比,硝酸益康唑的抑制作用更强,而且对正常肺上皮细胞BEAS-2B没有抑制作用。(3)idock软件预测硝酸益康唑与PI3Kα对接的构象图。硝酸益康唑通过与PI3Kα的ATP 口袋的ILE848和ILE932残基产生疏水作用,并在SER854位点形成氢键,从而与PI3K底物竞争结合。(4)Western blotting方法检测硝酸益康唑对肺癌细胞(H661和A549)PI3K靶蛋白有抑制作用,明显抑制了 AKT的磷酸化(抑制T308和S473两位点的蛋白表达),并抑制通路下游蛋白Bcl-2的表达,但不抑制VEGF和MMP-9的表达。而且对其他相似通路(ERK和p-ERK)无抑制作用。(5)硝酸益康唑通过诱导肺癌细胞的凋亡发挥抗癌作用。流式细胞术检测不同浓度的硝酸益康唑作用肺癌细胞(H661和A549),随着药物浓度的增加肺癌细胞早期凋亡比例和晚期凋亡/坏死比例逐渐增加,呈现良好的浓度依赖关系。Western blotting检测硝酸益康唑可以引起细胞内Caspase-3和PARP的裂解激活。(6)体内实验建立A549肺癌细胞移植瘤的裸鼠模型,腹腔注射硝酸益康唑(50mg/kg/d)21天。与对照组相比,腹腔注射硝酸益康唑(实验组)可以显著抑制肿瘤的生长,两组的裸鼠均未出现死亡,体重亦无明显差异。(7)硝酸益康唑和化疗药物(顺铂)联用对肺癌细胞的抑制有增效的作用。硝酸益康唑单药组、顺铂单药组和硝酸益康唑+顺铂两药联合组分别作用肺癌细胞(H661和A549),MTT检测两药联合组对肺癌细胞活性的抑制作用明显高于任何单药;Western blotting显示两药联合组对AKT的磷酸化和Bcl-2蛋白的抑制作用明显强于硝酸益康唑和顺铂单药作用。流式细胞技术分析,与任何单药组相比,两药联合组显著提高肺癌细胞的凋亡和坏死比例。两药联合组更容易引起Caspase-3和PARP蛋白的裂解激活。[结论]本课题应用计算机idock软件和生物学实验验证:抗真菌药硝酸益康唑作为一种新型PI3K抑制剂,抑制肺癌细胞的生长增殖,阻断PI3K/AKT信号通路并诱导肺癌细胞的凋亡,与化疗药物联合具有增效的作用。它可以作为治疗肺癌有效的小分子靶向药物,发挥其老药新用的价值。