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研究背景:肺癌为全球死亡率最高的恶性肿瘤之一。根据不同的组织学类型,肺癌可分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞癌,其中NSCLC约占85%,包括肺鳞癌,肺腺癌和大细胞癌。焦亡是一种炎性的程序性死亡方式,Gasdermin D(GSDMD)则是近新发现的焦亡执行分子,它可被炎性半胱天冬酶(caspases)剪切为活性的GSDMD-N片段,该片段可在细胞膜上形成相应的蛋白孔道,导致细胞肿胀、溶解死亡,这一过程同时伴随着IL-1β等一系列损伤相关分子模式(DAMPs)的释放,能够进一步扩大炎症反应。我们知道,炎症在肿瘤中有着独特的作用,焦亡通路中的一系列分子,如NLRP3等,均能够参与到肿瘤增殖、侵袭转移的调控之中,但是GSDMD在肿瘤中所发挥的作用尚不清楚。本课题主要探讨GSDMD在NSCLC中发挥的生物学功能。研究方法:1.用肺腺癌和肺鳞癌组织芯片检测GSDMD在NSCLC及其癌旁组织的蛋白表达水平,并分析GSDMD的表达水平高低和临床病理学特征及预后的相关性。2.在高表达GSDMD的PC9和H1703细胞系用小干扰RNA进行敲降实验,并用MTT实验、平板克隆形成实验检测GSDMD对细胞增殖的影响。3.在敲降GSDMD的NSCLC细胞系中,用Annexin V/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡数目,JC-1染色流式细胞术检测线粒体膜电位(MMP)的变化,Western blot实验检测凋亡相关蛋白的表达,乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验检测LDH的释放。4.在敲降GSDMD的PC9细胞系中给予(或不给予)外源性脂多糖(LPS)和三磷酸腺苷(ATP)处理后通过Western Blot检测炎性小体通路相关蛋白,免疫酶联吸附试验(ELISA)实验检测IL-1β的释放,流式细胞术检测Annexin V/PI染色情况、光学显微镜观察细胞死亡形态。5.通过MERAV数据库下载肺癌的标准化GEO芯片,使用Morpheus在线分析平台分析GSDMD共表达的相关基因,并通过OmicShare在线分析平台对共表达基因进行KEGG富集分析。最后用Western Blot验证富集通路的相关蛋白的表达。6.在PC9细胞系中用慢病毒载体shRNA敲降GSDMD,建构裸鼠皮下移植瘤模型,检测裸鼠肿瘤大小、体积的变化,并用Ki-67免疫组化染色检测肿瘤细胞增殖,TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡。研究结果:1.肺腺癌组织芯片的免疫组化染色显示,相对于癌旁正常组织,GSDMD在肺腺癌中呈现高表达;GSDMD的蛋白表达水平和肿瘤的大小、分期正相关;GSDMD蛋白的高表达提示患者的差预后。2.肺鳞癌组织芯片的免疫组化染色显示,相对于癌旁正常组织,GSDMD在肺鳞癌中呈现高表达;GSDMD的蛋白表达水平和肿瘤的TNM分期正相关;但GSDMD表达水平与肺鳞癌患者预后无关。3.在PC9和H1703细胞系中敲降GSDMD后,细胞的增殖能力显著下调、克隆形成数目明显减少。4.在NSCLC细胞系中敲降GSDMD后,早期凋亡及晚期凋亡的细胞数显著增多,MMP显著下调,凋亡相关蛋白PARP-1和caspase-3的剪切形式均增多。LDH实验提示敲除GSDMD的NSCLC细胞系不伴有LDH释放的增多。而在敲除GSDMD的NSCLC细胞系中加入caspases抑制剂z-VAD-FMK可部分逆转GSDMD对肿瘤增殖的抑制作用。5.NSCLC细胞系中存在内源性的炎性小体的激活,表现为NLRP3、caspase-1、剪切caspase-1蛋白的表达及细胞上清IL-1β的释放。给予外源性LPS/ATP激活PC9细胞系中的NLRP3后,未敲降GSDMD组仅表现为Annexin V/PI染色双阳性增多,光镜下细胞呈现肿胀的焦亡形态;而敲降GSDMD组表现为Annexin V染色单阳性及Annexin V/PI染色双阳性均增多,光镜下细胞呈现皱缩的凋亡形态。6.KEGG富集分析显示,GSDMD共表达的相关基因富集在Rap1信号通路、ErbB信号通路、PI3K-Akt信号通路等。我们选取与肿瘤细胞增殖、凋亡调控最为密切相关的PI3K-Akt信号通路进行进一步验证。Western blot显示敲降GSDMD后,磷酸化EGFR、磷酸化Akt、磷酸化mTOR蛋白的表达均下调。7.裸鼠皮下移植瘤实验显示,敲降GSDMD的PC9细胞系成瘤能力下降,肿瘤体积、重量均显著减少;敲降GSDMD的肿瘤组织表现为Ki-67染色减少,TUNEL染色阳性增多。结论:GSDMD在肺腺癌和肺鳞癌中均呈现高表达,并且是肺腺癌患者独立的预后影响因素,但与肺鳞癌患者预后无关。敲降GSDMD后能够显著抑制NSCLC细胞的增殖并通过激活casapse-3促进NSCLC细胞的凋亡。细胞凋亡和焦亡通路可能存在交互作用,敲降GSDMD后,内源性及外源性激活的NLRP3/caspase-1信号通路可能参与细胞凋亡的调控。此外,共表达分析显示GSDMD还可能参与调控EGFR/Akt信号通路。