目的对本地区临床检出的广泛耐药鲍曼不动杆菌(XDRAb)对碳氢霉烯类抗菌药物耐药机制从耐药表型及碳青霉烯酶相关基因型、外排泵和外膜蛋白、生物膜的形成等方面进行分析,探讨其可能存在的耐药机制,为临床预防、治疗和感染控制提供一定的理论基础。方法1、回顾性调查临床分离鲍曼不动杆菌(Ab)耐药情况;应用全自动微生物鉴定药敏分析仪对菌株进行鉴定,并采用微量肉汤稀释法对常用抗菌药物进行敏感性检测;根据CLSI2016标准,将菌株分为仅多粘菌素或米诺环素敏感为主要表现的XDRAb(25株)和对照组Ab(23株)两组进行后续实验。2、分别用改良EDTA双纸片增效法检测两组菌株中金属β-内酰胺酶,用碳青霉烯类失活法检测碳青霉烯酶、双纸片协同增效法检测染色体介导AmpC酶、使用改良三维试验法检测质粒介导AmpC酶。3、用羰基氰氯苯腙(CCCP)联合抗菌药物对鲍曼不动杆菌的抑制试验检测XDRAb和对照组Ab两组的外排泵表型;用SDS-PAGE电泳检测Ab外膜蛋白的表达或缺失。4、用结晶紫染色法分别测定抑制剂乳酸锌和氟化亚锡加入前后两组Ab生物膜形成能力,用棋盘稀释法检测抑制剂联合亚胺培南或美罗培南对Ab的敏感性。5、用 PCR 方法检测耐药基因blaOXA-23、blaOXA-24、blaTEM、blaAmpC、blaVIM/、blaNDM及外排泵相关耐药基因ade A、B、调控基因ade R、S、外膜蛋白相关CarO、OprD基因的携带情况;扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统观察并记录结果。用实时定量RT-PCR方法检测外膜蛋白及外排系统相关基因的表达量。6、抽取部分PCR扩增阳性产物进行双向测序,所得序列经拼接后与基因库相关基因进行一致性比对分析,以明确鲍曼不动杆菌是否携带相关耐药基因,并查找有无错义突变。结果1、广泛耐药鲍曼不动杆菌占临床分离不动杆菌的62.5%,对照组Ab对IMP和MEM的耐药率达39.6%。XDRAb集中分布于各类重症监护病房、呼吸内科、神经内科、脑外科。2、25株XDRAb中,编号为XDR16、43、55、84的菌株碳青霉烯酶阳性,另21株XDRAb和23株对照组Ab均阴性;编号为XDR21的菌株金属β-内酰胺酶阳性,编号为XDR39的菌株染色体介导AmpC酶阳性,其余23株XDRAb均表现为质粒介导AmpC酶阳性;另外23株对照组Ab均阴性。3、25株XDRAb和23株对照组Ab中,IMP联合CCCP抑制试验分别检测出外排泵表型阳性菌株16株和8株(X2=4.090,P= 0.043),MEM联合CCCP抑制试验分别检测出外排泵表型阳性菌株14株和6株(X2=4.410,P= 0.036),两者比较差异均有统计学意义。4、XDRAb和对照组Ab两组中生物膜形成率为96.3%和95.8%,生物膜抑制试验阳性率分别为77.9%和69.6%,二者差异均无统计学意义(P>0.05)。抑制生物膜形成前后XDRAb对碳青霉烯类药物的耐药性明显下降,而对照组Ab对碳青霉烯类药物的耐药性下降不明显。5、在25株XDRAb和23株对照组Ab中,均未检出金属β-内酰胺酶相关耐药基因blaVIM、blaNDM和外排泵调节相关基因adeR。其余9个目的耐药基因的检出率除blaTEM外,差异均有统计学意义(P<0.05)。qRT-PCR检测11株XDR-Ab和9株对照组Ab的外排泵基因mRNA相对表达量,发现XDRAb组adeA和adeB及外膜蛋白CarO基因mRNA相对表达量明显高于对照组Ab组(P<0.001),差异均有统计学意义。6、所抽取部分PCR阳性产物测序结果显示,编号N9、N11的菌株adeA基因碱基序列同源性均为91%,编号N17的OprD基因碱基序列同源性为95%,其他菌株PCRI阳性产物的序列同源性均为98%-100%。结论1、本地区临床分离的鲍曼不动杆菌主要来自重症监护、呼吸内科等科室,耐药性严重,广泛耐药鲍曼不动杆菌分离率高。2、介导本地区XDRAb碳青霉烯类耐药的主要机制为质粒介导持续高产AmpC酶,其次为外排泵ade ABC和外膜蛋白Car0、碳青霉烯水解酶、染色体介导AmpC酶和金属β-内酰胺酶介导的耐药机制。3、介导本地区XDRAb碳青霉烯类耐药的主要基因有blaOXA-23.bla(?).adeA、adeB、carO等,未检出金属β-内酰胺酶相关耐药基因;编码外排泵和外膜蛋白的相关基因序列改变,可能与碳青霉烯类耐药相关。4、生物膜形成是鲍曼不动杆菌的普遍生物学特性,其介导的耐药机制无统计学意义。乳酸锌和氟化亚锡可以有效抑制鲍曼不动杆菌生物膜形成;与碳青霉烯类药物联用可降低后者的MIC。