支撑脂双层膜的制备及其功能化研究

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细胞膜维持着细胞内各部分结构的稳定性,在细胞和外界环境的物质交换及信息传递、蛋白质等大分子的生物合成过程中均发挥重要作用。由于细胞膜本身结构的复杂性使其难以分离,目前一般采用人工构筑的脂双层膜来研究生物膜的结构、性质和功能。支撑脂双层膜(supported lipid bilayers,SLBs)是细胞膜研究中普及的模型,是固定生物活性蛋白的理想材料,不仅可以保持蛋白的活性,还能有效抑制其他生物分子的非特异性吸附,在细胞膜表面受体与配体的相互作用、免疫突触的形成等研究中具有广泛的应用前景。然而,支撑脂双层膜制备及功能化过程中仍有很多问题有待解决,如何制备出优质支撑脂双层膜一直是科学家们关注的热点。本文以亲水玻璃载玻片为基底,以L-α-二油酰磷脂酰胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DOPC)与{亚氨基二乙酸丁二酰(镍盐)}(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)],DGS-NTA)为原料制备支撑脂双层膜,通过纳米粒度-Zeta电位测试仪分析多层囊泡(muti-lamellar vesicle,MLV)及单层囊泡(small unilamellar vesicles,SUV)的粒径与电位分布,采用荧光漂白恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)研究DOPC与DGS-NTA原料配比、制备方法、漂白区域大小及两种蛋白P-选择素(P-selectin)和细胞间粘附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)加载不同浓度对脂双层膜流动性及扩散系数的影响。结果表明:1)声波破碎法优于薄膜挤压法,分散得到的SUV粒径更小、更均匀且更稳定;2)支撑脂双层膜形成过程须避免接触空气,否则将直接导致制备的膜没有流动性;3)随着原料中DGS-NTA摩尔占比由2%增加到20%,脂双层膜流动性及荧光恢复率逐渐减小,当DOPC与DGS-NTA摩尔配比为82∶18时,制备的膜已失去流动性;4)膜的荧光恢复速度和扩散系数随漂白区域的增大而减小,虽然不同大小漂白区域的荧光恢复速度呈现规律性差异,但在漂白后250 s内其荧光值均可恢复至90%以上;5)加载P-selectin和ICAM-1蛋白浓度10~40 nmol/L范围内,支撑膜的荧光强度随蛋白浓度线性增加,蛋白在膜上具有很好的流动性。P-selectin与ICAM-1是炎症免疫应答及肿瘤转移等生理病理过程中的重要信号分子。因此,该研究不仅为人工膜制备方法的发展提供了新视角,也为细胞膜分子之间的相互作用及后续信号响应的研究搭建了一个良好的生物膜平台。
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