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SP-A (surfactant protein A, SP-A)蛋白是肺泡上皮分泌的一种亲水性糖蛋白,该基因的表达在机体呼吸系统先天性免疫防御中发挥重要作用。与哺乳动物SP-A的研究相比,家禽SP-A的研究较为滞后。到目前为止,仅在基因库注册了鸡SP-A(chicken surfactant protein A, cSP-A)前体mRNA基因序列,有关cSP-A蛋白的组织分布、功能及其免疫机制研究还未见相关报道。本研究的主要目标是通过基因工程的方法获得cSP-A蛋白,从而为cSP-A蛋白的深入研究及临床应用做好铺垫,主要包括以下几个方面内容。首先,根据已注册的cSP-A前体mRNA基因序列设计一对引物,提取健康120日龄三黄鸡的肺组织总RNA,进行RT-PCR,产物连接到pEASY-Blunt并测序。测序结果与GenBank上登陆的cSP-A前体mRNA 100%同源,利用生物信息学软件对cSP-A氨基酸序列进行分析并进行结构预测,结果表明cSP-A具有C型凝集素家族的共同结构特征,通过与其他哺乳动物SP-A比较,发现cSP-A的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain, CRD)区较为保守,推测是与病原微生物发生凝集或粘附反应的主要功能区。其次,根据cSP-A的CRD编码区基因序列,在不影响其蛋白结构的情况下,参考大肠杆菌对密码子的偏嗜性,将部分碱基突变,人工合成该基因插入到pMD19-T载体中,再亚克隆到pGEX-6P-1载体中进行原核表达,通过对条件优化,成功高效表达了cSP-A-CRD重组蛋白。再次,对SP-A-CRD重组蛋白进行纯化,以纯化后的蛋白作为抗原腹腔注射小鼠制备抗cSP-A多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,Western blot法、免疫荧光组织化学染色和ELISA鉴定该抗体的特异性和适用范围。试验结果获得了效价达到105的鼠抗cSP-A血清；Western blot法结果表明该多抗血清具有良好的特异性和反应原性,并可用免疫荧光组织化学技术检测鸡肺上皮细胞、气管上皮细胞等组织表达的cSP-A蛋白和用间接ELISA检测鸡肺灌洗液中存在的水溶性cSP-A蛋白。最后,对cSP-A-CRD重组蛋白切胶回收,并用蛋白回收试剂盒纯化,纯化后的蛋白分别进行平板凝集试验和琼脂孔穴扩散抑菌试验。结果表明cSP-A-CRD重组蛋白,在钙离子的参与下能够凝集禽伤寒沙门氏菌多价抗原；琼脂孔穴扩散抑菌法检测结果显示cSP-A-CRD蛋白对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、乙型副伤寒(CMCC50094)、大肠杆菌(CMCC44102)及巴氏杆菌等也均有一定的抑菌活性。综上所述,cSP-A蛋白具有一般SP-A蛋白的结构特征,经修饰表达的cSP-A-CRD蛋白具有很好的免疫原性和反应原性,且具有一定的生物学活性。制作的鼠抗cSP-A-CRD血清能够特异性的与cSP-A蛋白反应,可用来检测cSP-A在鸡体内的组织分布。