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羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin,HCPT)是20世纪六十年代从我国特有的琪桐科植物-喜树中分离提取的一种微量生物碱,这类药物与其他常用的抗肿瘤药无交叉耐药,在同类抗肿瘤单体中其抗癌作用最强。动物实验证明.HCPT为细胞周期特异性药物,对S期的作用最为明显。HCPT在许多国家已获得广泛应用,与喜树碱(CPT)相比,HCPT在治疗肿瘤方面具有高效、低毒的特点。它还是FDA批准临床应用的依立替康(Irinotecan。CPT-11)和拓扑替康(Topotecan,TPT)的半合成前体化合物。由于HCP工具有抗癌谱广、活性高、毒性小、疗效显著的特点,对HCPT的研究成为众多药学工作者关注的热点。
HCPT的脂溶性和水溶性差,半衰期短,并具有不稳定性。利用现代药剂学方法,研究HCPT新的制剂,以达到提高载药量、增加药效基团-内酯环稳定性、延长血中循环时间以及降低不良反应等目的。目前研究较多的有HCPT乳剂、微球、胶束、脂质体、半固体脂质纳米粒、非离子表面活性剂、泡囊等形式。
本课题组建立了一种新的微沉淀-高压匀质法用于羟基喜树碱纳米晶体(hydroxycamptothecin.nanocrystals,HCPT-NCs)制备,本实验以自制的HCPT-NCs为对象,以肝癌SMMC-7721细胞为模型,与原制剂注射用羟基喜树碱(hydroxycamptothecin injection,HCPT-I)比较,以评价其抗肿瘤作用。
目的：观察HCPT-NCs与原制剂HCPT-I比较的体外抗肿瘤作用及其作用机制并作出评价。
方法：
1.HCPT-NCs对SMMC-7721细胞增殖抑制作用的影响
实验分为3组:HCPT-NCs组、HCPT-I组、无药物干预组。药物组分别加入5种不同浓度的HCPT药液,每个浓度设5个平行孔。分别用HCPT-NCs和HCPT-I药液作用SMMC-7721细胞24h、48h、72h,MTT法测定吸光度(A)值,计算细胞的生长抑制率和药物的IC50值,比较HCPT-NCs和HCPT-I对SMMC-7721细胞的增值抑制作用。
2.HCPT-NCs对细胞凋亡率和凋亡相关基因survivin表达的影响
应用流式细胞仪分析HCPT-NCs作用于SMMC-7721细胞后的细胞凋亡率；免疫细胞化学法检测HCPT-NCs对SMMC-7721细胞内凋亡相关蛋白survivin表达的影响；RT-PCR方法检测survivin mRNA表达的变化。检测HCPT-I诱导SMMC-7721细胞凋亡能力和对survivin表达的影响,同样条件下与原制剂比较。
结果：
1.HCPT-NCs对SMMC-7721细胞增殖抑制作用
HCPT-NCs对SMMC-7721细胞有显著的增殖抑制作用,且随着HCPT浓度的增加,抑制率逐渐升高,呈现剂量依赖性和时间依赖性。HCPT-NCs和HCPT-I相比对SMMC-7721细胞的增值抑制作用,24小时无显著性差异(P>0.05),48小时和72小时存在显著性差异(P<0.05)。HCPT-NCs的IC50和HCPT-I相比,作用24小时差别不大,作用48小时降低了1.15倍,作用72小时降低了2.75倍。结果表明,HCPT-NCs对SMMC-7721肿瘤细胞的抑制作用明显优于HCPT-I,并且随着时间的延长,作用越明显。
2.HCPT-NCs诱导SMMC-7721细胞凋亡
2.1 HCPT-NCs对SMMC-7721细胞凋亡率的影响
流式细胞术分析细胞凋亡率随着HCPT浓度的增加逐渐增加,HCPT-NCs和HCPT-I相比,浓度20μg/mL时,凋亡率[(21.59±0.91)％vs(18.12±0.23)％](P<0.05)；浓度40μg/mL时,凋亡率[(56.12±1.06)％vs(50.85±2.68)％](P<0.05)；浓度80μg/mL时,凋亡率[(86.68±2.17)％ vs(75.02±1.85)％](P<0.05)。
2.2 HCPT-NCs对SMMC-7721细胞survivin mRNA表达的影响
经HCPT干预后,随着浓度的升高,survivin mRNA表达逐渐下调。HCPT-NCs和HCPT-I相比,存在显著性差异(P<0.05),HCPT-NCs对下调survivinmRNA表达的影响较大。
2.3 HCPT-NCs对SMMC-7721细胞survivin蛋白表达的影响
经HCPT干预后,随着浓度的升高,survivin蛋白表达逐渐下调。HCPT-NCs和HCPT-I相比,存在显著性差异(P<0.05),HCPT-NCs对下调survivin蛋白表达的影响较大。
结论：
1.HCPT-NCs对SMMC-7721细胞有显著的增殖抑制作用,其抑制作用呈现明显的剂量依赖性和时间依赖性,与HCPT-I相比,存在显著性差异。
2.HCPT-NCs可以明显的下调SMMC-7721细胞中survivn基因和蛋白的表达,显示出较强的诱导SMMC-7721细胞凋亡的抗癌活性,与HCPT-I相比,存在显著性差异。
总之,HCPT制成纳米晶体后,体外抗肿瘤活性显著增强。