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研究背景和目的2型糖尿病的发病与胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍密切相关。葡萄糖诱导的胰岛素1相分泌受损是胰岛β细胞功能障碍的最早标志,但致其损害的发生机制尚不清楚。既往研究证明胰岛素分泌是由胰岛β细胞内Ca2+的迅速升高直接触发的,细胞内Ca2+升高主要来源于细胞膜上钙通道的Ca2+内流和胞内钙库Ca2+释放。葡萄糖刺激胰岛素分泌颗粒外排依赖于外钙内流。细胞膜上SNARE蛋白、L型钙通道和胰岛素分泌颗粒聚集在一起形成紧密的功能性复合体,有利于局部高钙形成,激发胰岛素分泌颗粒外排。虽已有报道:排空酸性钙库抑制胰岛素分泌(INS-1细胞),但关于胰岛素分泌颗粒内钙离子含量的变化是否对胰岛素1相分泌有影响,还未见报道。目前多采用钙离子荧光探针间接反映胰岛β细胞内整体钙离子浓度的变化,而直接在亚细胞水平对钙离子进行定位、定量分析的研究报道还比较少。本研究采用改进的焦锑酸钾沉淀的细胞化学方法结合透射电子显微镜技术,对大鼠胰岛β细胞的胰岛素分泌颗粒内钙离子进行定量研究,探讨胰岛素分泌颗粒内钙离子在胰岛素1相分泌中的作用。方法以高脂饲料和普通饲料分别喂养2组雄性SD大鼠,共5月。每7天经禁食12小时后,尾部末梢采取血样,经离心后,将上清液保存于-70℃冰箱。饲养结束后,作静脉糖耐量实验,血浆胰岛素采用放射免疫法检测;大鼠胰腺经胆总管内逆行插管注入Ⅴ型胶原酶液消化,Histopaque-1077纯化后,获得纯度较高的胰岛;高脂饲料组和普通饲料组分离纯化的胰岛及外源性胰岛素孵育正常SD大鼠的胰岛0min和240min后,采用焦锑酸钾沉淀的细胞化学方法结合透射电子显微镜技术对胰岛β细胞的胰岛素分泌颗粒内钙离子进行定位定量。主要实验结果1.在高脂饲料饲养SD大鼠的过程中,大鼠空腹血浆胰岛素水平逐渐升高。当大鼠空腹血浆胰岛素水平高至基础胰岛素水平的2～3倍时,胰岛素1相分泌出现损害。电镜研究发现高脂饲料组胰岛β细胞近膜胰岛素分泌颗粒内钙离子比普通饲料组明显减少(P <0.01)。2.外源性胰岛素孵育胰岛β细胞240min后,近膜胰岛素分泌颗粒内钙含量比正常对照组明显减少(P <0.01),胰岛素1相分泌严重受损;IP3受体阻断剂2-APB或Xestospongin C(Xec)可阻断外源性胰岛素导致的胰岛素分泌颗粒内钙离子减少。提示胰岛素是通过作用于胰岛素分泌颗粒上的IP3受体而使钙离子外排的。结论1.胰岛素分泌颗粒内高浓度的钙离子是维持胰岛素分泌所必须的。2.胰岛素通过作用于胰岛素分泌颗粒上的IP3受体,使Ca2+释放,导致胰岛素1相分泌损害。