论文部分内容阅读
目的:太阳紫外辐射能够引起人类皮肤的急性和慢性损伤,而中波紫外线（Ultraviolet B,UVB）作为到达地球表面中最危险的紫外线,可引起皮肤炎症、老化,进而促进皮肤癌的发生与发展。DNA直接损伤和活性氧（Reactive oxygen species,ROS）生成过多间接导致的DNA断裂是UVB损伤效应的重要病理生理过程。机体有对抗氧化应激的防御机制,特别是碱性亮氨酸拉链家族。其中NF-E2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）可以通过谷胱甘肽（Glutathione,GSH）介导的途径保护皮肤细胞免受UVB诱导的凋亡。但结构与Nrf2高度相似的NF-E2相关因子3（Nuclear factor erythroid 2-related factor 3,Nrf3）反而会通过抑制细胞粘附从而增强UVB诱导的角质形成细胞凋亡。而作为碱性亮氨酸拉链家族的另外一个成员NF-E2相关因子1（Nuclear factor erythroid 2-related factor 1,Nrf1）,其在UVB诱导的皮肤角质形成细胞损伤中的作用机制仍不明确。本研究利用角质形成细胞Nrf1特异性敲除小鼠和慢病毒稳定转染的NRF1基因沉默的HaCaT细胞系,从体内和体外两方面研究Nrf1在UVB诱导的皮肤角质形成细胞损伤中的作用及机制。研究方法:1.检测基础条件下Nrf1在皮肤中的表达与分布:收取小鼠背部皮肤,通过H&E染色观察角质形成细胞Nrf1特异性敲除小鼠即Nrf1（K）-KO小鼠与Nrf1-KI小鼠的皮肤结构和角质形成细胞形态,并通过免疫荧光染色检测两者角蛋白K14和K6的表达以及免疫组化检测巨噬细胞F4/80和中性粒细胞Ly6G+的表达。2.建立UVB照射诱导的皮肤急性晒伤模型:小鼠在麻醉状态下未进行任何处理,即对照组;小鼠在麻醉状态下进行300 mJ/cm2的UVB照射,即UVB实验组。照射后24 h收取小鼠及背部皮肤组织。通过H&E和TUNEL染色,观察UVB照射后的角质形成细胞的形态。3.病理染色检测Nrf1在UVB诱导的角质形成细胞损伤中的作用:将8周龄雌性小鼠分为6组,即K14-Cre+/-对照组,Nrf1-KI对照组,Nrf1（K）-KO对照组,K14-Cre+/-实验组,Nrf1-KI实验组,Nrf1（K）-KO实验组。收取小鼠背部皮肤通过HE染色和TUNEL染色分析Nrf1缺失对角质形成细胞的影响。4.检测DNA损伤相关指标:将8周龄雌性小鼠分为6组,即K14-Cre+/-对照组,Nrf1-KI对照组,Nrf1（K）-KO对照组,K14-Cre+/-实验组,Nrf1-KI实验组,Nrf1（K）-KO实验组。收取小鼠背部皮肤,通过免疫组化法测定DNA损伤指标H2AX磷酸化蛋白γ-H2AX和环丁烷嘧啶二聚体（Cyclobutane pyrimidine dimer,CPD）在表皮层中的表达。通过GraphPad Prism 6测定小鼠表皮层中的阳性细胞数量,进行统计学分析。5.NRF1基因沉默与验证:用携带靶向NRF1 shRNA的慢病毒（NRF1 knockdown,NRF1-KD）与Scramble细胞,用1μg/mL嘌呤霉素筛选稳定感染的细胞。用qPCR法检测NRF1的转录水平。用10 nM环氧内霉素（Eponemycin,EPO）分别处理Scramble细胞和NRF1-KD细胞6 h,并通过Western Blot法检测NRF1蛋白水平的表达。6.UVB处理HaCaT细胞:给予非靶标阴性对照慢病毒（Scramble）转染的HaCaT细胞2 J UVB照射后,分别在1 h、3 h、6 h、12 h和24 h收取样品,进行NRF1的mRNA水平检测。用10 nM环氧内霉素（Eponemycin,EPO）（10 nM,6 h）和高剂量UVB（8 J/cm2,6 h）联合处理检测NRF1蛋白水平的表达。7.凋亡相关指标的检测:分别对Scramble和NRF1-KD的HaCaT细胞给与1 J、2J、5 J和8 J的UVB照射处理24 h后进行台盼蓝染色。通过流式细胞术Annexin/V-PI双染进行细胞凋亡检测,并通过Western Blot法检测凋亡蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP蛋白的表达水平。8.DNA损伤修复相关指标的检测:分别对Scramble和NRF1-KD的HaCaT细胞给予1 J UVB照射处理后通过全视野细胞仪分别检测0、12 h、24 h、36 h、48 h细胞增殖情况。分别对Scramble和NRF1-KD的HaCaT细胞给与2 J UVB照射处理后,分别在0、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h收取样品检测DNA损伤识别因子C组着色性干皮病调节因子（Xeroderma pigmentosum C,XPC）的mRNA水平。9.统计分析:本研究所有数据均使用GraphPad Prism 6软件进行数据分析。结果:1.角质形成细胞Nrf1特异性敲除对小鼠皮肤结构和功能的影响:背部皮肤切片HE染色、免疫荧光（K14和K6）染色、F4/80和Ly6G+免疫组化染色分别显示,Nrf1（K）-KO小鼠表皮层、真皮层和皮下脂肪层的厚度,表皮角质形成细胞形态,角蛋白分化,炎症反应与Nrf1-KI小鼠相比无明显差异。2.Nrf1敲除促进了UVB诱导的角质形成细胞凋亡:300 mJ/cm2 UVB照射可以诱导角质形成细胞凋亡形成细胞胞质呈嗜酸性,均匀一致,胞核皱缩深染的晒伤细胞,且Nrf1（K）-KO小鼠表皮层晒伤细胞和TUNEL阳染细胞数都明显高于K14-Cre+/-和Nrf1-KI小鼠,约为3倍,差异有统计学意义（P<0.05）。3.Nrf1缺失加重了UVB诱导的光产物形成促进DNA损伤:与对照组相比,UVB实验组的表皮层出现γ-H2AX阳染细胞和CPD阳染细胞,且与Nrf1-KI小鼠相比Nrf1（K）-KO小鼠γ-H2AX阳染细胞和CPD阳染细胞明显增加,约为其2.5倍,具有统计学差异（P<0.05）。4.NRF1基因沉默稳转细胞建立成功:NRF1-KD组HaCaT细胞靶基因mRNA和蛋白水平均显著低于Scramble组,差异有统计学意义（P<0.05）。5.急性UVB暴露诱导NRF1上调:UVB照射6 h后,Scramble组细胞的NRF1mRNA水平表达上调（P<0.05）;单次UVB处理可以诱导Scramble组细胞NRF1表达上调,而与EPO组相比,UVB和EPO联合处理后Scramble组细胞NRF1表达明显上调。6.NRF1基因沉默促进UVB诱导的细胞凋亡:UVB 1 J、2 J、5 J和8 J处理细胞24h后,Scramble和NRF1-KD组细胞凋亡率均显著高于对应的对照组,且细胞凋亡与UVB剂量呈剂量反应关系（P<0.05）;与Scramble组相比,NRF1-KD组细胞凋亡率明显增加（P<0.05）;同时,NRF1-KD组Cleaved Capspase-3和Cleaved PARP蛋白水平明显高于Scramble组。7.NRF1可能是通过影响了DNA损伤修复在UVB诱导的细胞凋亡中起了保护作用:给予1 J UVB处理后,NRF1-KD组细胞增殖速度明显低于Scramble组,且差异有统计学意义（P<0.05）。给予2 J UVB处理后,NRF1-KD细胞的XPC的mRNA水平与Scramble组无明显差异。结论:1.Nrf1角质形成细胞特异性敲除小鼠在基础条件下的皮肤结构与功能无明显改变。2.Nrf1缺失会促进UVB诱导的角质形成细胞凋亡。3.Nrf1可能通过减少UVB诱导的光产物的形成在DNA损伤修复中发挥作用。