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目的:采用原位末端标记法(TUNEL)和免疫组化的方法检测便秘大鼠胃、回肠、横结肠粘膜和肌层细胞凋亡及凋亡相关基因bcl-2、bax的表达,并与正常对照组进行对比,以进一步了解细胞凋亡与便秘大鼠胃肠道病变之间的联系。方法:1动物分组:选取健康Wistar大鼠40只,雌雄各半,按照完全随机的方法进行分组,实验组20只,对照组20只,分组后各组间体重、性别无显著性差异。2模型建立:实验组采用大黄浸液灌胃,首日剂量为800mg/kg(生粉),此后每日剂量在前一日基础上增加200mg/kg(生粉),直至实验组出现半数大鼠粪便变稀,保持剂量至80%的稀便消失,继续加量给药,至又有半数大鼠粪便变稀,如此程序循环3次,待实验组第三次80%的稀便消失一周后停止建模,对照组以同等体积蒸馏水灌胃。3动物处理:切取试验组及对照组大鼠胃窦、回肠、横结肠标本,进行HE染色,采用原位末端标记法(TUNEL)及免疫组化PV法检测粘膜层和肌层的原位细胞凋亡及bcl-2、bax在粘膜层和肌层的表达。4统计分析:本实验应用SPSS13.0统计软件,选用Wilcoxon秩和检验进行统计分析,检验水准α=0.05。5数据处理: 5.1凋亡检测阳性细胞细胞核染成棕黄色,凋亡指数(AI)的计算:每例标本随机选取5个高倍视野(400倍)至少计算1000个细胞中凋亡细胞所占百分比。5.2 bcl-2、bax切片结果以细胞核和细胞质内出现黄到棕褐颗粒为阳性细胞。在染色效果好、阳性细胞分布均匀的区域,计数高倍镜视野下100个细胞中阳性细胞数,以百分数表示。免疫阳性细胞数超过10%作为组织阳性诊断标准,再根据高倍镜下阳性强度划分无色为阴性(一).淡黄色为弱阳性(十)、棕黄色为阳性(十十)和棕褐色为强阳性(十十十)。最后运用显微图像分析系统(VIDAS),分别测定胃、回肠、横结肠粘膜与肌层免疫反应产物的平均光密度值。结果:1 TUNEL标记的阳性细胞(凋亡细胞)主要表现为胞核棕黄色着色,胃肠道不同层次均有阳性细胞分布。实验组胃粘膜凋亡细胞明显多于对照组(p<0.05);实验组胃肌层凋亡细胞多于对照组(p<0.05);实验组回肠粘膜凋亡细胞多于对照组凋亡细胞(p<0.05);实验组回肠肌层凋亡细胞与对照组相比无显著差异(p>0.05);实验组横结肠粘膜凋亡细胞多于对照组凋亡细胞(p<0.05);实验组横结肠肌层凋亡细胞多于对照组(p<0.05)。2免疫组化bcl-2、bax染色:试验组、对照组大鼠胃、回肠与横结肠粘膜层、肌层均可见细胞明显着色,显色大多位于胞浆,也有在胞核内,为棕黄色,有的表现为小颗粒状呈弥散性或者片状分布。试验组大鼠胃粘膜与肌层bcl-2、bax的表达比较对照组大鼠均明显增强(p<0.05),试验组大鼠回肠粘膜bcl-2与bax的表达比较对照组大鼠明显增强(p<0.05),试验组大鼠回肠肌层bcl-2与bax的表达比较对照组大鼠无显著意义(p>0.05),试验组大鼠横结肠粘膜bcl-2与bax的表达比较对照组大鼠均明显增强(p<0.05),试验组大鼠横结肠肌层bcl-2的表达比较对照组大鼠均明显增强(p<0.05),试验组大鼠横结肠肌层bax的表达比较对照组大鼠无显著意义(p>0.05)。3胃肠道大体病理变化及HE染色:两组大鼠胃肠道外观无明显差别,粘膜无色素沉着。对照组大鼠胃肠道切片HE染色未发现病变,实验组大鼠胃肠道切片HE染色可见粘膜慢性炎症改变,胃肠道全层大量嗜酸性粒细胞浸润,以固有膜为主,粘膜下肌层部分增厚,胶原纤维化,固有膜水肿,肌层胶原纤维增生,肌间神经丛神经细胞空泡变性、减少。结论:1便秘大鼠胃肠道粘膜层和肌层的凋亡细胞比较对照组明显增多,表明便秘大鼠胃肠道病变包括粘膜和肌层。2便秘大鼠胃、回肠、横结肠粘膜层与肌层凋亡细胞明显增多,提示便秘大鼠胃肠道病变不仅局限于结肠,胃与回肠同样发生病变。3便秘大鼠胃、横结肠肌层凋亡细胞明显多于对照组。说明便秘大鼠肌层病变特别是神经元的退行性改变和凋亡有密切关系。4便秘大鼠胃肠道bcl-2的表达比较对照组大鼠胃肠道增强,会增加患胃肠道肿瘤的危险。