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棉花作为一种自然纤维、植物蛋白和食用油的重要来源,具有非常重要的经济和社会价值。现在异源四倍体棉花的种植最为广泛,其基因组大而复杂的特点给棉花基因和基因组功能的研究提出了挑战,但科学家一直在探索和发明新的生物技术去更为有效和精准地研究棉花的基因功能。CRISPR/Cas9系统作为一种最新的基因组编辑技术,由于具有简单、高效、灵活、低廉的优点,自从出现以来就被广泛应用于多种物种的基因组编辑研究。本研究利用CRISPR/Cas9系统对陆地棉GhCLA1和GhVP基因进行了定点突变,分别在棉花子叶原生质体和转基因植株中检测了该系统对两个基因的编辑情况,还在转基因植株中检测了CRISPR/Cas9系统的脱靶情况。针对棉花构建了棉花特异性的CRISPR/Cas9系统表达载体,初步在棉花子叶原生质体中对GhVP基因进行了定点突变研究,同时也利用Cas9-sgRNA蛋白(RNP)复合体对GhVP基因在体外和体内的编辑效果进行了初步研究。主要结果如下:1.利用半定量PCR对棉花GhCLA1和GhVP基因的表达情况进行检测,发现两个基因的表达均比较活跃,可以作为基因编辑的靶标。针对GhCLA1和GhVP基因分别设计了5个sgRNA,经初步在棉花子叶原生质体中验证,最终选取了GhCLA1-sgRNA5和GhVP-sgRNA4作为本研究中两个基因的靶标位点。2.通过PEG介导的原生质体遗传转化法将构建好的CRISPR/Cas9系统植物表达载体转入棉花子叶原生质体,提取原生质体DNA并用相应的限制性内切酶(GhCLA1-sgRNA5为Pst I,GhVP-sgRNA4为Hinf I)充分酶切后,利用高保真酶PCR扩增GhCLA1和GhVP基因的靶标片段,测序后发现,多数靶标位点发生了碱基的替换,GhCLA1基因的一个靶标位点在存在单个碱基替换的情况下还有单个碱基的插入,同时还发现GhCLA1基因的一个靶标位点发生了单个碱基的插入,而GhVP基因的一个靶标位点发生了单个碱基的删除。3.通过农杆菌介导的棉花茎尖遗传转化方法将CRISPR/Cas9系统转入棉花,通过PCR检测Cas9基因确定转基因阳性植株,分别获得了22株GhCLA1-sgRNA5和18株GhVP-sgRNA4阳性苗。通过RE-PCR分析,结果发现,4株GhCLA1-sgRNA5和3株GhVP-sgRNA4阳性苗靶标位点的碱基发生了改变。为了验证是否是基因编辑的结果,将目标条带PCR测序后发现,两个基因的靶标位点均发生了突变,多数突变是碱基的删除,而1株GhCLA1-sgRNA5阳性苗的突变是单个碱基的插入。同时,琼脂糖凝胶电泳的检测结果表明CRISPR/Cas9系统对这7株阳性苗靶标基因的编辑并不完全,因此,我们检测了它在这7株阳性苗中的编辑效率,结果发现,GhCLA1基因的编辑效率为55.0%-81.8%,而GhVP基因的编辑效率为47.6%-57.9%。4.我们检测了CRISPR/Cas9系统在这7株转基因棉花基因组编辑过程中是否存在脱靶现象。我们通过分析获得了GhCLA1-sgRNA5的22个潜在脱靶序列,分布于陆地棉基因组的36个基因位点上,而GhVP-sgRNA4有19个潜在脱靶位点,分布于28个基因位点上。利用RE-PCR分析方法结合测序,分别验证了GhCLA1-sgRNA5的13个基因位点和GhVP-sgRNA4的17个基因位点,结果并没有检测到脱靶现象。这表明CRISPR/Cas9系统对棉花基因组编辑具有非常高的特异性。5.我们用编码陆地棉氨基酸的密码子优化了Cas9基因,并克隆了陆地棉的U6启动子,然后将它们构建到pBI121载体上,获得了棉花特异性的CRISPR/Cas9系统植物表达载体。以GhVP为靶标基因,选取构建好的4个pBI121-GhCas9-GhU6-GhVP-sgRNA4载体(GhU6-1P、GhU6-2P、GhU6-3P和GhU6-6P)转入棉花子叶原生质体,结果发现,GhU6-1P、GhU6-2P和GhU6-3P均造成了GhVP基因靶标位点的碱基改变,大多数是碱基的删除,少数是碱基的替换或插入,而GhU6-6P没有检测到靶标基因碱基的改变。6.我们还初步研究了Cas9-sgRNA蛋白复合体(RNP)对GhVP基因在体外和体内的编辑情况。首先在体外检测了RNP对靶标位点的切割情况,结果发现,RNP对GhVP基因靶标位点的切割效率非常高,可以完全将目标基因的PCR产物切开。将RNP复合体转入棉花子叶原生质体,结果发现,与使用初始的CRISPR/Cas9系统得到的结果类似,GhVP基因的靶标位点大多数情况是单个碱基的替换,少数是单个碱基的删除或插入。