【摘 要】
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丁香酚（2-甲氧-4-丙烯基酚,Eugenol）是一种挥发强烈丁香香气的生物活性化合物,对鱼类具有强烈麻醉效果,且具来源广、成本低、效果好且残留期短等优点而被广泛应用于渔业麻醉,但有研究指出其对人体存在致癌和肝损伤的风险。我国尚未对鱼用麻醉剂丁香酚的使用发布明确规定,市场对其使用存在混乱和滥用的现象,因此开发快速、高效、准确的检测方法可为水产品的正常流通和质量保证提供技术支撑。本研究通过合成丁香酚
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丁香酚（2-甲氧-4-丙烯基酚,Eugenol）是一种挥发强烈丁香香气的生物活性化合物,对鱼类具有强烈麻醉效果,且具来源广、成本低、效果好且残留期短等优点而被广泛应用于渔业麻醉,但有研究指出其对人体存在致癌和肝损伤的风险。我国尚未对鱼用麻醉剂丁香酚的使用发布明确规定,市场对其使用存在混乱和滥用的现象,因此开发快速、高效、准确的检测方法可为水产品的正常流通和质量保证提供技术支撑。本研究通过合成丁香酚半抗原,制备丁香酚人工抗原和单克隆抗体,对丁香酚胶体金免疫层析和时间分辨荧光免疫层析技术条件进行优化,并开发了相应的检测试纸条。主要研究内容如下:（1）丁香酚人工抗原的合成与鉴定本研究通过亲核取代法合成丁香酚半抗原,采用质谱及核磁鉴定合成结构,然后通过碳二亚胺法将合成的半抗原与载体牛血清白蛋白（Albumin from bovine serum,BSA）及鸡卵清白蛋白（Ovalbumin,OVA）偶联合成丁香酚免疫抗原（Eugenol-COOH-BSA）和检测抗原（Eugenol-COOH-OVA）,采用紫外扫描和蛋白凝胶电泳进行鉴定。（2）抗丁香酚单克隆抗体的制备与鉴定使用合成的丁香酚免疫抗原（Eugenol-COOH-BSA）对小鼠进行免疫,采用杂交瘤技术筛选得到高灵敏度和纯度的抗丁香酚单克隆抗体,其浓度为4.05 mg/m L,对抗原抗体工作浓度优化得到,检测最佳抗原浓度为2μg/m L,最佳抗体浓度为0.63μg/m L,最终确定抗丁香酚单克隆抗体的竞争抑制标准曲线方程为:y=9.671lnx+10.539,R~2=0.998,IC50为0.0592μg/m L,除与异丁香酚的交差反应率达到7.4%外,与丁香酚其他结构类似物（甲基丁香酚、甲基异丁香酚、乙酸丁香酚酯和乙酰基异丁香酚）的交叉反应率均小于0.01%,表明抗体特异性较好。（3）丁香酚检测试纸条的研制首先以胶体金作为信号输出载体制备试纸条,通过透射电子显微镜和紫外-可见分光光度仪对胶体金及标记探针进行表征,并对免疫层析试纸条的相关参数进行了工艺优化,具体包括胶体金标记p H、标记抗体量、标记抗体时间、T线及C线缓冲体系和封闭液、样品垫处理液、T线和C线包被浓度以及胶体金标记抗体喷量,初步开发研制了丁香酚的胶体金免疫层析试纸条,其T线消失浓度为2.0μg/m L,裸眼检出限为0.3μg/m L。其次以时间分辨荧光微球为标记物制备试纸条,分别对比不同型号的荧光微球和硝酸纤维素膜择优选择,对试纸条制备工艺进行了优化,包括微球活化时间、标记缓冲液p H、荧光微球标记抗体的添加量等,根据最终优化结果制备得到荧光试纸条标准曲线为y=-2.415lnx+2.5894,R~2=0.994,消线浓度为1.0μg/m L,裸眼检出限为0.3μg/m L,仪器检出限为0.1μg/m L。对所制备的荧光试纸条进行性能测试,向中转水水样中添加低中高浓度的丁香酚,试纸条回收率基本稳定在94%-109%之间,且批内和批间变异系数均小于8%,呈现出良好的精密度;将试纸条结果与高效液相色谱结果进行线性拟合得到方程:y=-1390.1x+1767.9,R~2=0.995,呈现出良好的准确性;经高温破坏性实验证明,试纸条可在常温密封条件下至少保存1年,呈现良好的稳定性。结果表明,建立的胶体金免疫层析法可用于定性及半定量的检测,而时间分辨荧光免疫层析法可满足现场定量检测的需求,两种试纸条均可实现现场方便快速检测实际样品的要求,为商品化丁香酚快检试纸条的研发奠定了基础。
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