牛病毒性腹泻/粘膜病毒（BVDV）引起牛从亚临床、短暂感染到持续感染等严重的呼吸道、胃肠道、生殖性多系统疾病,给世界养牛业带来巨大的经济损失。疫苗接种是该病主要的预防策略之一,目前常用疫苗是BVDV全病毒灭活疫苗。但是,随着病毒的不断变异,灭活疫苗的免疫效果已经不能满足临床上对该病的防控,迫切需要研发新型BVDV疫苗。BVDV NS5A、E0、E2是重要抗原蛋白,有望发展成为新型亚单位疫苗。目的:探索利用大肠杆菌重组表达BVDV NS5A、E0、E2、mE2T（串联E2）蛋白研制亚单位疫苗,以及抗原蛋白与灭活疫苗配伍免疫以提高灭活疫苗的免疫保护效果,为BVDV新型亚单位疫苗研发提供理论依据。方法:（1）BVDV NS5A、E0、E2和mE2T质粒转化入大肠杆菌,经IPTG诱导表达后,Ni-NTA Resin镍柱纯化备用。（2）纯化抗原蛋白与弗氏完全佐剂混合配制亚单位疫苗。分别设计试验分为E0亚单位疫苗、串联E2亚单位疫苗、商品灭活疫苗、串联E2配合商品灭活疫苗及PBS对照组。（3）各组疫苗对小鼠进行3次免疫,每次免疫时间间隔为14天。每次免疫进行ELISA抗体效价检测与白细胞计数。（4）攻毒前使用小鼠ELISA试剂盒检测小鼠血清中的免疫指标及小鼠的体重。攻毒后再次检测小鼠免疫指标与体重的变化并进行攻毒后的白细胞计数。（5）对小鼠无菌摘除脾脏进行脾脏淋巴细胞分离,并进行淋巴细胞增殖的MTT检测。采用固定病毒稀释抗血清的方法,进行抗体中和试验。在攻毒后的第7、14天取小鼠组织混合样本,进行qRT-PCR,分析BVDV拷贝数的表达变化。（6）将各组疫苗对已经检测为BVDV阴性的绵羊进行3次免疫,每次免疫间隔14天。在每次免疫后对绵羊进行颈静脉沟采血,进行ELISA抗体效价检测与白细胞计数。（7）在攻毒前使用绵羊ELISA试剂盒检测绵羊血清中的免疫指标及绵羊的体重。绵羊第3次免疫后的第14天对绵羊进行攻毒,在攻毒后再次检测绵羊免疫指标与体重的变化并进行攻毒后的白细胞计数。（8）绵羊进行全血淋巴细胞分离,并进行淋巴细胞增殖的MTT检测。采用固定病毒稀释抗血清的方法,对绵羊血清进行抗体中和试验。在攻毒后的第7、14天取绵羊的全血提取RNA并反转录为c DNA进行qRT-PCR,分析BVDV拷贝数的表达变化。结果:（1）浓缩出了浓度较高的BVDV-1a病毒液,经3次TCID50的测定,浓缩的BVDV-1a病毒液浓度为1×10~8/ml。（2）经过Ni-NTA Resin镍柱纯化后,纯化出了BVDVNS5A、E0、E2、mE2T蛋白,经WB检测反应原性良好。（3）BALB/c小鼠3次免疫后,能使小鼠抗体水平显著提升,并且联合疫苗的抗体水平显著高于单组分的亚单位疫苗与灭活疫苗。但攻毒后空白对照组的白细胞数明显少于各个疫苗组的白细胞数。（4）免疫指标和小鼠白细胞数与空白对照组相比均有显著提高。攻毒后的免疫指标与攻毒前相比均有显著差异,各组小鼠攻毒前后的体重变化并不显著。（5）经细胞试验:淋巴细胞增殖的MTT检测及固定病毒-稀释抗血清法进行抗体中和试验验证,小鼠脾脏淋巴细胞相应蛋白及灭活病毒的刺激下均可刺激脾脏淋巴细胞增殖。小鼠血清BVDV病毒均有良好的中和能力。（6）对BVDV易感动物绵羊的试验证明亚单位疫苗免疫绵羊依然能够激发较高水平的抗体水平。空白对照组的白细胞数也明显少于各个疫苗组的白细胞数。（7）攻毒后的免疫指标与攻毒前相比均也显著提高,绵羊各个疫苗组的体重与攻毒前相比均没有显著差异,但空白对照组攻毒后体重下降明显。（8）经细胞试验:淋巴细胞增殖的MTT检测及固定病毒-稀释抗血清法进行抗体中和试验验证,绵羊全血分离的淋巴细胞在相应蛋白及灭活病毒的刺激下均可刺激脾脏淋巴细胞增殖。绵羊血清对BVDV病毒均有良好的中和能力。经qRT-PCR验证,BVDV亚单位疫苗对小鼠和绵羊均有一定的保护作用,使其体内BVDV拷贝数相比对照组显著下降。其中联合疫苗在qRT-PCR验证出现的BVDV病毒拷贝量极低。结论:BVDV功能蛋白NS5A、E0、E2和mE2T在大肠杆菌系统中成功表达。经小鼠试验证实各组疫苗可以显著提高小鼠的抗体水平。经易感动物绵羊试验证实,疫苗同样可以显著提高绵羊的抗体水平。通过细胞、不同种的动物试验及qRT-PCR验证,证明各组疫苗均可以降低BVDV病毒复制。其中联合疫苗组的效果优于其它各组疫苗,为以后BVDV疫苗的制备打下了基础。