论文部分内容阅读
第一部分 Runx2／Cbfa1转录因子的基因组结构与表达分布 Runx2（又名Cbfa1,Osf2,PEBP2αA和AML3）是一个结构较为复杂的基因。它具有两个启动子：P1和P2，分别转录两个主要mRNA异构体Runx2-Ⅱ和Runx2-Ⅰ。Runx2Ⅱ与Ⅰ的区别在于5′-端非翻译区（分别称为UTR1和UTR2）和N-端氨基酸序列，而其余DNA结合区和C-端氨基酸序列完全相同，并由外显子2到8编码。Runx2-Ⅱ（又称为主要til-1，Cbfa1.iso or Cbfa1／p57）由远端的P1启动子所转录，能编码出528个氨基酸残基蛋白，其N-端19个氨基酸MASNSLFSAVTPCQQSFFW位于外显子1a。Runx2-Ⅰ（又称为PEBP2αA，Cbfa1／org或Cbfa1／p56）由近端的P2启动子所转录，能编码出514个氨基酸残基蛋白，其N-端5个氨基酸MRIPV位于外显子1b。尽管我们知道Runx2基因编码两个主要的成骨细胞特异性转录因子，调节成骨细胞的分化，但目前对于他们的5′-端基因组结构及其在成骨细胞，各种不同细胞株和不同的组织中表达还要进一步研究。 在目前实验研究中，我们已弄清人、大鼠、和小鼠RUNX2-Ⅱ／Runx2-Ⅱ基因5′-端序列结构特征，并对Runx2-Ⅱ和Runx2-Ⅰ两个主要异构体在成骨细胞、细胞株及各种组织中的表达进行了分析。我们发现新的5′-端RUNX2-Ⅱ／Runx2-Ⅱ序列（外显子1a）在不同种系中高度保守，小鼠、大鼠、和人的序列同源性为97％。小鼠外显子1a被含有165个碱基对的微内含子分为两个部分，至少有两个剪接供体位点（sd1和sd2）在5′端UTR1非翻译区及一个剪接供体位点（sd3）在外显子1a翻译区。交替性剪接供体位点（sd1和sd2）选择可使Runx2-Ⅱ产生另外两个转录异构体Runx2-Ⅱd1和Runx2-Ⅱd2，Runx2-Ⅱd2仅在Runx2-Ⅱ5′-端UTR1中存在33个核苷酸插入不同。采用扩增外显子1a引物及小鼠MC3T3E1 mRNA，我们获得了三种不同的RT-PCR产物并做了克隆和测序分析，其中克隆包括没有剪接的UTR1u，UTRd1和UTRd2序列。基于推断的RUNX2-Ⅱ／Runx2-Ⅱ氨基酸序列在小鼠、大鼠、和人的相似性，很强的翻译启动Kozak同源序列在ATG1周围及在人体中缺乏独特的OSF2序列结构转录体，表明Runx2／Osf2异构体翻译起始点应为MASNSL（ATG1），而不是新的N-端Osf2序列MLHSPH（ATG3）。引物的延伸作图分析证实在Runx2-ⅡP1启动子区域存在次要的mRNA转录起始点，位于编码Runx2-Ⅱ（MASNS）异构体ATG1 5′-端上游约0.8kb，或从前报道 ．X．、〔、‘．8＿劣 wL要转录起始点上游约 0．4 kb。 Northern blot分析揭示：用 RunxZ外显子 la和二共同探针杂交，在 MC3T3上 l和 ROS0．8成骨细胞株 rnRNA poly（A）可见 6．0和 5．4 kb两个 主要转录异构体。而用外显子 la探针仅测到较小的 5．4 kb 杂交带 旧u。2．11)，较大的 6刀 kb杂交带是否为 Runx－I或其他 Runx需要进一步 用外显子比探针鉴别。另外，RTPCR克隆测序证实，含有 RunxZ转录体在 二 成骨细胞中分别或同时存在外显子2和5跳跃性剪接J产生内在性外显子删 除。因此，在 Northern blot观察到的多条次要及较小的杂交带可能代表这些 选择性丢失外显于2和5的转录体。 为了查明RunxZ表达的细胞种类特异性，我们应用PTICR，RNase酶保 护分析及 Real丁ime PCR技术分析RunxZ异构体在不同细胞种类中的表达情 况。我们发现除JUrket细胞外，所有测试细胞均表达Rund－I异构体。除非 成骨细胞Hepa 16和NIH3T3细胞外，其他细胞包括多潜能C3H10TI／2， CZCIZ，软骨细胞CS二8，和成骨细胞MC3T3EI，U’i－106，ROS17／2．8均 表达Ru。2＊异构体。用Ru毗一11特异性核酸探针问39，465)进行RNase 酶保护分析，证实在成骨细胞MC3T3E，ROS17a．8中出现227和124 hp 两条杂交带上27加杂交带代表在了端非翻译区中含有微内含子的RU地a－11U， 而124中杂交带代表被剪接掉微内含子的RUnxZ－1llnRNA。＊2C12细胞 BMPZ刺激后 RunxZ－11明显增加，RealTime PCR证实在各种细胞之间 RunxZ－ImRNA表达无明显差异，但与NIH3T3，C2C12，C3H10TI／2细胞比 较，RunxZ－11 mRNA及其5”端异构体在成骨细胞MC3T3＊ 中有较高的表达。 Western b］川分析证实在 MC3T3E 和 NIH3T3 RunxZ蛋白表达高于 CZC12 不C3HmTI／2细胞。此外，采用RUm2一二千RU肛2－1特异性弓物RT．PCR， 我们发现RU—2－11信使RN A从小鼠胚胎第7天至第17天渐进性明显增加； 但 RunxZ王表达主要出现在第 11天。同时这两个异构体均在成年鼠长骨及肺 中表达，而RunxZ王还在军九及骨骼肌表达。其他组织如心脏、大脑，脾脏、 肝脏、肾脏中均无两异构体表达。 结论：1)RunxZ＊和Runx－I均在成骨细胞和骨组织中表达，它们的功 能需进一步确定；2)多种 RunxZ转录异构体的存在表明 Pre．InRNA剪接在 调节细?