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布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌（Brucella）侵入机体后引起的人畜共患慢性细菌性疾病，近年来，布鲁氏菌病已严重阻碍农牧区的经济发展，对人类健康造成严重的威胁。布鲁氏菌外膜蛋白(Omp)一直被视为布鲁氏菌研究的热点，刺激机体后可产生IgG抗体，且诱导机体产生强烈的免疫反应。布鲁氏菌诊断方法的建立大都基于LPS抗原，本试验试图建立一种基于外膜蛋白作为诊断抗原，用于高通量、快速检测布鲁氏菌抗体的间接ELSIA方法。 本文以布鲁氏菌外膜蛋白BP26、OMP31和OMP25为研究对象，PCR方法从布鲁氏菌S2疫苗株中扩增获得目的片段，成功构建原核表达质粒pET-28a-BP26、pGEX-6p-1-OMP31、pGEX-6p-1-OMP25，转入大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE分析表明，重组蛋白均成功表达，BP26、OMP31、OMP25蛋白分子质量分别为33kDa、52kDa、49kDa，与预期大小一致。通过镍柱亲和层析法纯化His融合蛋白pET-28a-BP26，通过KCl染色切胶纯化法纯化GST融合蛋白pGEX-6p-1-OMP31和pGEX-6p-1-OMP25。最后经Western blot分析表明3种重组蛋白均能与羊布鲁氏菌病阳性血清发生特异性反应。 将纯化的重组蛋白BP26、OMP31和OMP25分别以2ug/mL、3.5ug/mL、3ug/mL包被酶标板，对40份田间野毒感染羊血清样本进行检测，并用SVANOVA-ELISA试剂盒进行平行检测，将两种检测结果进行比较，结果显示，重组抗原BP26、OMP31和OMP25的敏感性分别为90.9％、86.9％、86.9％，特异性分别为83.3％、80％、76.9％。随后，将三种重组蛋白间接ELISA分别检测由试管凝集试验(SAT)检测均为阳性的羊血清20份，阴性羊血清10份。结果显示，重组抗原BP26的P/N值明显大于其它两个重组抗原的P/N值，因此，将BP26确定为诊断用抗原。 以纯化的重组蛋白BP26作为包被抗原，通过优化反应条件，建立布鲁氏菌病抗体ELISA榆测方法。结果表明，通过反应条件优化确定抗原的最佳稀释度为1∶3200，血清最佳稀释度为1∶20，二抗的最佳工作浓度为1∶20000，通过批间、批内重复性试验，变异系数均小于10％，表明本检测方法具有较高的重复性。用该方法对100份临床样本进行检测，并与试管凝集试验(SAT)进行相符性验证，符合率为94％。为布鲁氏菌病临床血清抗体检测及流行病学调查提供了技术手段。