酶是一切生命活动的基础,是机体内一切化学变化的激发促进者。蛋白酶主要由20种氨基酸组成。酶是高效催化剂,它可以提高反应速度的范围在5-17个数量级。酶促反应催化机理包括酸碱催化、金属离子催化、共价催化等。酶反应体系复杂且大多数反应迅速,仅仅通过实验手段难以确定反应中间体和过渡态的结构,以及各步基元反应的能量学信息。理论化学在酶催化反应机理方面具有独特的优势,计算结果可以与实验工作相互补充,对深入理解酶促反应发挥着不可或缺的作用。本论文主要采用分子动力学模拟以及量子力学和分子力学组合方法对两种酶的催化反应进行了较为系统的理论研究,在晶体结构的基础上构建了相应的计算模型,详细分析了反应中涉及的中间体和过渡态的结构特点和能量学信息,确定了酶催化反应的最可能路径。这些计算结果为深入理解酶催化反应奠定了一定的理论基础。主要研究内容如下:(1)双加氧酶NOV1催化白藜芦醇氧化裂解的机理研究NOV1是一种芪类裂解加氧酶(SCO),可以氧化裂解二苯乙烯的中心双键,形成两种酚醛。由NOV1的活性位点可知,铁辅因子与四个组氨酸配位且无负电荷配体,这对于含铁酶来说是不常见的。因此,基于最近获得的NOV1的晶体结构,我们用量子力学/分子力学(QM/MM)方法对NOV1的反应机理进行了研究。根据计算确定了铁氧复合物的两种结合模式(分子氧双配位模式和分子氧端基单配位模式),并且端基单配位模式利于催化。从晶体结构中获得的分子氧双配位模式是一种非活性形式,应首先转变为分子氧端基单配位模式以启动催化反应。对于氧端基单配位模式的反应物,三重态和五重态的能量接近。在所考虑的三条路径中,有两种途径(path_a路径和path_b1路径,仅在第一个C-O键形成的顺序上有所不同)包含二氧杂环丁烷中间体,这两条途径被认为是有利的,由此可以证实NOV1的双加氧酶机制。然而,涉及环氧乙烷中间体的路径(path_b2路径)在形成第二个C-O键时具有较高的能垒(三重态和五重态下分别为27.49和31.56 kcalmol-1),可以排除。另外,在path b2路径中,环氧乙烷中间体的形成很容易,且可以与溶剂水(非酶反应)反应形成副产物。此外,底物4’-OH和K134的不同质子化状态,以及水分子是否与铁配位,都不影响反应能垒。(2)PrhA(V150L/A232S)/AusE催化机理研究PrhA是一种来自青霉菌的α-酮戊二酸加氧酶,它可以催化多种类型的氧化反应。前人根据实验结果提出了PrhA(V150L/A232S)催化反应的大致机理,但是一些反应细节仍然是未知的。我们基于PrhA(V150L/A232S)与共底物(α-酮戊二酸)和底物(preaustinoid A1)复合物的晶体结构,构建了α-酮戊二酸-底物酶的复合物模型,并采用量子力学和分子力学(QM/MM)方法探讨了 PrhA(V150L/A232S)或AusE的催化机理。计算结果表明,整个催化反应包括三步连续的反应,分别为:去饱和化过程,碳骨架重排生成螺内酯和甲基羟基化过程,三步连续反应都是通过抽提H原子引发反应。反应主要在五重态下进行,在去饱和化过程中,抽提H1原子的能垒为19.4 kcal mol-1;重排反应中,中间体抽提H3原子的能垒为23.6 kcalmol-1;甲基化过程中,抽提H6原子的能垒为21.8 kcalmol-1。我们猜测造成不同能垒的主要原因是FeⅣ=O或FeⅢ-OH中间体中氧原子与氢原子的相对位置(距离或角度)不同。PrhA与AusE实现功能转化可能是由于残基突变导致FeⅣ=O复合物与底物不同位置上H的相对位置发生改变。本论文的创新和特色之处:1.在原子水平上揭示了 NOV1催化机理,通过计算确定了分子氧与铁的两种结合模式,给出了碳碳双键裂解过程的最低能量路径,证明了底物4’-OH的质子化状态不影响反应的势垒,并表明底物4’-OH对底物的结合起主要作用。这些研究结果可为深入理解NOV1的催化作用以及相似加氧酶裂解双键提供有用的信息。2.揭示了PrhA(V150L/A232S)的催化机理,阐明了两种蛋白酶PrhA与AusE实现功能转化的原因,通过探讨活性中心电子结构和几何结构与反应能垒的关系阐明了H抽取过程的相关规律。