论文部分内容阅读
套细胞淋巴瘤(MCL)来源于淋巴结滤泡外套B细胞异常增殖,以染色体t(11;14)(q13;q32)易位导致细胞周期蛋白cyclinD1的过表达为特征,多见于老年男性,发展迅速,属侵袭性淋巴瘤,传统化疗后复发率高,预后不佳,中位生存期仅为3-5年;因此积极探索疾病发病机制,寻找特异性肿瘤标志物和有效靶向治疗成为最具潜力的突破方向。Kruppel样因子(Kruppel-like factor,KLF)是一类在人类组织中广泛表达的含锌指结构的转录因子。KLF家族蛋白在许多不同的生理活动如细胞增殖、生长、分化和正常组织稳态的维持中发挥重要作用。KLF4基因包含3个结构域:DNA结合结构域、转录调节结构域和核定位序列。其中高度保守的DNA结合结构域位于羧基端,一般用来调节DNA结合的特异性;转录调节结构域位于氨基端,发挥转录激活或抑制作用。KLF4在不同的肿瘤组织中可以通过与不同的靶基因作用,发挥促癌或者抑癌两种完全相反的功能。KLF4在乳腺导管癌和口腔鳞癌中表达上调,被认为是癌基因;而在胃肠道肿瘤如食管鳞癌、胃癌、结肠直肠癌,肺癌、膀胱癌、前列腺癌中表达减低发挥抑癌作用。在血液病研究中发现,KLF4在弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤和cHL中发挥抑癌基因的作用且常发生因基因启动子甲基化导致的沉默。而KLF4在MCL中的表达水平及作用尚未有明确报道。Wnt信号通路在B细胞的正常分化增殖中高度保守且具有重要意义,近期研究表明Wnt/β-catenin通路在MCL中都处于异常活化状态,并与肿瘤的发生进展密切相关。正常状态下,β-catenin由GSK-3β等组成的复合物磷酸化降解并在细胞中保持低水平表达。细胞受到异常刺激时,GSK-3β组成的复合物活性受抑制,大量非磷酸化β-catenin在细胞质中积聚并转入细胞核中,β-catenin在细胞核中与TCF形成复合体使得下游如c-myc,cyclinD1,MMP7等与细胞增殖、侵袭相关基因异常激活,从而参与促进肿瘤的发生发展。有文献报道KLF4在胃肠道肿瘤中可通过抑制Wnt/β-catenin通路发挥抗肿瘤作用;在多能干细胞研究中KLF4与β-catenin协同诱导端粒酶催化亚单位的表达,从而参与细胞生长的调控。砷剂早在古希腊和古代中国时期就被当做药物和毒药使用。三氧化二砷(ATO)联合口服维甲酸(ATRA)已经成为初治非高危型APL的标准治疗方案。ATO也开始在其他恶性血液病领域有进一步的研究观察。然而,在MCL中ATO的相关研究报道甚少。DNA甲基化是目前肿瘤研究中的热点之一,大量研究表明肿瘤发生发展中存在抑癌基因甲基化水平和模式的调控紊乱。由于DNA甲基化为可逆性调控,因此可以作为肿瘤靶向治疗的重要研究调控方向。在胃肠道肿瘤及部分淋巴瘤中均有发现KLF4启动子区域因甲基化而导致的基因沉默,提示KLF4启动子甲基化可能与肿瘤发生进展密切相关。本研究应用细胞生物学、分子生物学、免疫学及慢病毒转染介导基因过表达等技术,探讨了 KLF4与ATO通过调控Wnt信号通路在MCL疾病发生发展中的调控作用及机制,为寻求新的分子标志物和靶向治疗提供分子生物学依据。第一部分:KLF4在套细胞淋巴瘤中调控机制研究目的:KLF4为锌指蛋白类核转录因子,是多能干细胞(iPS)的诱导因子之一,可在不同肿瘤中与不同的靶基因相互作用发挥抑癌或促癌作用。KLF4随B细胞成熟度增高而表达升高,在多种血液肿瘤中发现表达减低、缺失。有研究表明KLF4在血液恶性疾病中的作用仍存在争议。套细胞淋巴瘤来源于淋巴结滤泡外套B细胞异常增殖,发展迅速,属侵袭性淋巴瘤,预后不佳,因此积极探索疾病发病机制,寻找肿瘤标志物和有效靶向治疗成为最具潜力的突破方向。本研究旨在探讨KLF4在套细胞淋巴瘤中表达及其影响因素,及对Wnt信号通路的调控和机制。材料与方法:1.细胞培养和切片组织标本收集;2.RNA提取、逆转录和实时定量PCR;3.免疫组织化学染色;4.蛋白提取和western blot分析;5.慢病毒载体转染介导MCL细胞株KLF4过表达;6.流式细胞仪检测细胞凋亡,CCK8法检测细胞增殖;7.免疫沉淀(IP)法检测KLF4与β-catenin结合情况;8.统计学分析。结果:1.通过实时定量PCR、western blot结果分析,与健康志愿者相比较,套细胞淋巴瘤细胞株(Jeko-1,Mino,SP53)中KLF4mRNA、蛋白表达均明显减低。免疫组化分析显示套细胞淋巴瘤患者淋巴瘤组织石蜡标本中KLF4表达水平均减低,且其表达水平与套细胞淋巴瘤患者分期密切相关(P<0.05)。2.通过western blot结果分析,套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1,Mino,SP53中β-catenin、c-myc、cyclin D1的蛋白表达与健康志愿者相比明显升高。免疫组化结果分析套细胞淋巴瘤患者淋巴瘤组织标本中KLF4表达水平与β-catenin表达水平相关(P<0.05)。3.流式细胞仪检测分析显示,慢病毒介导过表达KLF4的Jeko-1细胞凋亡增加,CCK8法检测KLF4过表达Jeko-1细胞增殖受抑制,上述细胞株中β-catenin、c-myc表达下调,IP结果表明KLF4与β-catenin发生了蛋白结合。4.通过western blot、免疫组化结果分析,套细胞淋巴瘤细胞株(Jeko-1,Mino,SP53)以及套细胞淋巴瘤患者淋巴瘤组织石蜡标本中DNMT-1表达水平与正常对照标本相比均增高。去甲基化药物5-azaC处理Jeko-1,Mino细胞后,去甲基化转移酶-1(DNMT-1)表达受抑制,而KLF4表达水平升高,Wnt/β-catenin通路分子表达受抑制。结论:本研究表明KLF4在套细胞淋巴瘤中的表达水平与患者疾病分期密切相关,KLF4过表达可抑制β-catenin及其下游分子cyclinD1,c-myc的表达,通过免疫沉淀的研究证明KLF4表达增高后与β-catenin结合,使其不能进一步激活下游通路,是其发挥抑癌作用的机制之一。DNMT-1在套细胞淋巴瘤组织及细胞株内高表达,去甲基化药物可促使KLF4恢复表达,且抑制Wnt通路相关分子,说明KLF4基因在套细胞淋巴瘤中可能因基因甲基化沉默。KLF4的表达水平、原因分析及作用机制研究对探索套细胞淋巴瘤的致病机制有重要意义。第二部分:亚砷酸在套细胞淋巴瘤中通过调控Wnt/β-catenin通路和DNMT-1发挥抗肿瘤作用的机制研究目的:亚砷酸(ATO)已成为治疗急性早幼粒白血病标准方案药物之一,并在其它恶性血液病领域也有进一步的探讨研究。套细胞淋巴瘤是淋巴结滤泡外套B细胞异常增殖起源的非霍奇金淋巴瘤,病情进展迅速,属侵袭性淋巴瘤,预后不佳,因此积极探索疾病发病机制,寻找有效的抗肿瘤药物成为重点研究方向。本研究旨在评估ATO在套细胞淋巴瘤中的抗肿瘤作用及并进一步研究ATO相关作用的分子生物学机制。材料与方法:1.细胞培养和切片组织标本收集;2.免疫组织化学染色;3.蛋白提取和western blot分析;4.RNA提取、逆转录和实时定量PCR;5.ATO、5-azaC、LiCl按照所需药物浓度处理培养细胞;6.流式细胞仪检测细胞凋亡;7.统计学分析。结果:1.CCK8检测及流式分析结果显示ATO对套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1,Mino有显著的抑制增殖和促进凋亡作用,效果随药物浓度升高更显著。2.通过western blot、免疫组化结果分析,套细胞淋巴瘤细胞株(Jeko-1,Mino,SP53、Grant519)中β-catenin、c-myc、DNMT-1的蛋白表达与健康志愿者相比较均明显上调(P<0.05)。生存分析显示DNMT-1阳性表达的套细胞淋巴瘤患者在39个月前的生存率明显低于阴性患者。3.不同浓度ATO处理套细胞淋巴瘤细胞株(Jeko-1,Mino,SP53)后,western blot及实时定量PCR分析显示ATO可抑制细胞中DNMT-1和Wnt通路中β-catenin、及下游分子c-myc、cyclinD1、MMP7的表达,且抑制作用有剂量依赖性。4.Western blot结果分析显示ATO可以抑制由套细胞淋巴瘤细胞株细胞中LiCl刺激引起的β-catenin升高,并与5-azaC对DNMT-1的抑制有协同作用。结论:本研究表明ATO在套细胞淋巴瘤中发挥肿瘤抑制作用,对DNMT-1、Wnt/β-catenin通路有抑制剂量依赖性的抑制作用。ATO可拮抗LiCl对Wnt/β-catenin通路的激活作用,并可协同去甲基化药物5-azaC抑制DNMT-1的表达。以上结果表明ATO在套细胞淋巴瘤中治疗研究中有潜在研究意义及治疗前景。