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目的:探讨环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)在脑胶质瘤组织中的表达情况,以及应用CRISPR/Cas9技术敲除CREB后对人脑胶质瘤细胞系U251增值、迁移、侵袭、凋亡及体外成瘤的影响方法:一、组织检测1)采集术后不同级别的人脑胶质瘤标本,并收集正常颅脑外伤减压术后的脑组织作为空白对照,采用免疫组化法、RT-PCR、Western blot检测肿瘤标本CREB的表达情况。二、细胞检测1)建立稳定敲除的细胞系:采用CRISPR/Cas9技术敲除胶质瘤U251细胞系中的CREB基因,并建立稳定敲除的细胞株;并通过Cruiser?酶切筛选阳性KO克隆、Western blot检测敲除后的U251细胞系中CREB的表达情况;2)CRISPR/Cas9敲除CREB后对肿瘤细胞增殖的影响:采用CCK-8法检测通过CRISPR/Cas9敲除后的U251细胞株细胞增殖速度的改变并Western blot检测Cyclin D1的蛋白表达情况。3)CRISPR/Cas9敲除CREB后对肿瘤细胞迁移、侵袭的影响:采用Transwell小室检测敲低CREB前后U251细胞株迁移、侵袭能力的改变并Western blot检测E-cadherin的蛋白表达情况。4)CRISPR/Cas9敲除CREB后对肿瘤细胞凋亡的影响,并探究敲除后对ERK-CREB、PI3激酶/Akt-CREB两条重要的磷酸化信号通路影响,采用Western blot检测bcl-2、bax、p ERK、p Akt的蛋白表达情况。三、裸鼠检测1)U251细胞系裸鼠成瘤检测:BALB/C-nu裸鼠作为动物研究模型,将裸鼠随机分组,分别收集U251、U251-NT及U251-KO细胞进行皮下注射,绘制各组动物皮下移植瘤生长曲线,并对活体肿瘤标本中CREB的表达进行Western blot检测分析。结果:1)CREB在不同分化程度脑胶质瘤组织中均存在过表达现象,且不同级别胶质瘤中表达量有统计学意义(P<0.05),与肿瘤的分化程度呈正相关(P<0.05)2)CRISPR/Cas9敲除后的U251稳定细胞株中CREB的m RNA以及蛋白含量明显降低(P<0.05)。3)CRISPR/Cas9敲除后的U251稳定细胞株增殖、迁移以及侵袭能力明显降低,细胞凋亡增加,其磷酸化信号通路相关蛋白表达量也有明显变化,以上指标与对照组相比,均有统计学意义(P<0.05)。4)CRISPR/Cas9敲除后的U251稳定细胞株在裸鼠的成瘤能力与对照组相比,明显下降。结论:CREB在不同分化程度脑胶质瘤组织中均存在过表达现象,与肿瘤的分化程度呈正相关。在CRISPR/Cas9稳定敲除后的U251稳定胶质瘤细胞株中,细胞的增殖、迁移、侵袭以及裸鼠成瘤能力均下降,凋亡水平增加,因此我们推测CREB可能在胶质瘤发生发展过程中起着重要的调节作用。