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背景黑色素瘤是来源于黑色素细胞的一类恶性肿瘤,常见于皮肤,是恶性程度最高的皮肤肿瘤。既往治疗晚期黑色素瘤的药物种类少,疗效低,预后很差。近年来,免疫治疗和个体化靶向治疗的发展使黑色素瘤的治疗取得了突破性进展。研究发现,40-60%的黑色素瘤患者存在BRAF基因突变,其中90%为BRAFV600E突变,因此,靶向BRAF的小分子抑制剂成为研究热点。维罗非尼(Vemurafenib,PLX4032)是2011年批准进入临床应用的一种选择性BRAF抑制剂,直接靶向抑制MAPK信号通路活性,显著延长了患者的无进展生存期(PFS)和总生存期(OS),然而,大多数患者在治疗1年内发生耐药,出现病情进展。已报道的耐药机制主要有NRAS和MEK1突变或EGFR、PDGFRb、FGFRs和IGF1R等酪氨酸激酶受体(RTK)的过表达引起的MAPK信号通路再活化或PI3K/AKT信号旁路的激活等。PTEN是重要的抑癌基因,30%的黑色素瘤发生PTEN突变,且常与BRAF突变同时发生。PTEN缺失可通过活化PI3K/AKT通路和抑制细胞凋亡导致BRAF抑制剂的原发耐药,然而,某些PTEN突变型黑色素瘤仍然对BRAF抑制剂敏感。因此,PTEN基因状态与BRAF抑制剂耐药的关系目前并不完全清楚。本文重点研究PTEN基因状态是否影响黑色素瘤对BRAF抑制剂的获得性耐药及其具体机制。内容和方法1.以逐步增加药物剂量法诱导构建6株BRAF抑制剂耐药人黑色素瘤细胞株(4株PTEN野生型101、103、111和A375sm,2株PTEN突变型105和M28)。2.Western Blot检测PLX4032不同浓度或时间作用下,耐药细胞MAPK和PI3K/AKT信号通路的活化水平。3.CCK8检测BRAF、AKT和MEK抑制剂单独或联合对耐药细胞的增长抑制作用;CalcuSyn2.11软件分析药物协同效应。4.磷酸化RTK抗体阵列同时检测42种受体酪氨酸激酶(RTKs)在亲代细胞与耐药细胞中的相对磷酸化水平;以AXL抑制剂R428作用耐药细胞株,检测耐药细胞对BRAF抑制剂敏感性的变化。5.统计学分析:采用One-way ANOVA和Student t检验方法分别进行多组数据间和两组数据间的比较。结果1.成功诱导建立6株BRAF抑制剂耐药人黑色素瘤细胞株101R、103R、105R、111R、A375smR 和 M28R,耐药指数 RI 分别为 35.1、89.4、1.9、3.8、22.9 和 19.0。2.MAPK信号通路在PTEN突变型和野生型耐药细胞中均活化;PI3K/AKT通路仅在PTEN野生型耐药细胞中活化,在PTEN突变型耐药细胞中不活化或表达下调。3.PTEN野生型耐药细胞中,BRAF抑制剂与AKT抑制剂具有协同抑制效应,与MEK抑制剂无协同抑制效应;PTEN突变型耐药细胞中,BRAF抑制剂与AKT抑制剂或MEK抑制剂均有协同抑制效应,其中以与MEK抑制剂的协同效应更好;三种抑制剂联合仅在PTEN突变型耐药细胞中显示出比两药方案更好的效果。4.受体酪氨酸激酶AXL蛋白的磷酸化水平仅在PTEN野生型耐药细胞中明显升高;通过抑制AXL蛋白的磷酸化水平,耐药细胞对BRAF抑制剂的敏感性恢复,p-AKT的表达水平下调。结论1.不同PTEN基因状态的黑色素瘤对BRAF抑制剂的获得性耐药机制不同。2.PI3K/AKT信号通路的活化是导致PTEN野生型黑色素瘤对BRAF抑制剂耐药的主要机制之一;MAPK信号通路活化在PTEN突变型黑色素瘤对BRAF抑制剂耐药中起主导作用。3.受体酪氨酸激酶AXL通过激活PI3K/AKT信号通路介导PTEN野生型黑色素瘤对BRAF抑制剂的耐药,有可能是逆转BRAF抑制剂耐药的新靶点。