蝗灾是我国农业历史上的重大自然灾害,东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis (Meyen)是造成蝗灾的主要类群之一。在蝗虫防治工作中,目前仍以有机磷杀虫剂为主要手段,长期施用化学杀虫剂导致一系列问题：1)昆虫出现抗药性,用药剂量加大,防治成本提高；2)农药残留导致环境污染严重；3)对非靶标生物有较大影响。几丁质广泛存在于真菌、节肢动物和线虫中,高等哺乳动物和人类不含有几丁质,因此基于几丁质代谢途径设计新型杀虫剂已经成为研究热点。本文以东亚飞蝗为研究对象,对几丁质合成过程的关键酶之一几丁质合成酶(CHS)的分子特性及功能进行了较为系统和深入的研究,为基于几丁质合成酶开展蝗虫的有效控制提供科学依据。具体内容如下：一、东亚飞蝗几丁质合成酶基因的克隆运用生物信息学方法对东亚飞蝗表达序列标签数据库进行了全面搜索,得到3条几丁质合成酶基因片段。根据昆虫中已发表的几丁质合成酶基因保守氨基酸序列设计简并引物,RT-PCR扩增几丁质合成酶基因的大部分编码序列,RACE方法扩增东亚飞蝗两个几丁质合成酶基因的3’和5’末端序列,拼接后获得全长。根据所得基因的氨基酸序列信息和构建的昆虫几丁质合成酶基因的系统进化树,可知获得的两个几丁质合成酶基因分属于CHS1和CHS2两类,因此命名为LmCHS1和LmCHS2。LmCHS1全长5,116 bp,其中可读框4,728 bp,编码1,576个氨基酸,5’和3’非编码区分别为67 bp和321 bp；LmCHS2全长5,018 bp,其中可读框4,569 bp,编码1,523个氨基酸,5’和3’非翻译区分别为76 bp和373 bp。进一步扩增获得LmCHS1的两个交替外显子序列,命名为LmCHS1A和LmCHS1B,两者只有177 bp的差异,氨基酸水平上相似度达75%。预测LmCHS1蛋白的分子量为179 kDa,等电点为6.89；LmCHS2蛋白的分子量为174 kDa,等电点为6.65。二、东亚飞蝗几丁质合成酶基因的时空表达根据已经得到的东亚飞蝗几丁质合成酶基因核苷酸序列,设计特异性的表达引物,RT-PCR和Real-time PCR分析不同组织部位和不同龄期几丁质合成酶基因mRNA的表达。结果表明：LmCHSl在表皮和气管中高表达,其中LmCHS1A在表皮中高表达,LmCHS1B在气管中高表达,而LmCHS2在中肠和胃盲囊特异性表达,推测LmCHS1主要参与催化表皮和气管几丁质的合成,LmCHS2对于中肠和胃盲囊几丁质的合成起重要作用。LmCHS1在各个龄期都有表达,其中成虫期表达量最高,卵期最低；LmCHS1A和LmCHS1的表达规律相似,LmCHS1B在1、2、3龄和成虫期的表达量较高,卵期和4、5龄表达较低；而LmCHS2在卵期几乎没有表达,1-3龄随着龄期的增加其表达量也逐渐升高,3龄达到最高,其后几乎保持在同一水平。由此可见：几丁质合成酶对于东亚飞蝗各个龄期的发育都是必需的。三、东亚飞蝗几丁质合成酶基因的功能研究为进一步研究几丁质合成酶基因的功能及其对昆虫生长发育的影响,我们采用了RNA干扰(RNAi)技术。用体外注射的方法在东亚飞蝗2龄若虫体内实现了目标基因的沉默。当注射LmCHS1 dsRNA后,实验组飞蝗出现蜕皮时间延迟、生长发育缓慢、不能完成蜕皮等现象；注射LmCHS1A dsRNA的实验组表型与注射LmCHS1dsRNA的实验组表型相似；注射LmCHS1B dsRNA后,试验组飞蝗表现为全身皱缩而死亡；注射LmCHS2 dsRNA后,实验组取食量明显下降,不能满足昆虫的生长发育而死亡。注射LmCHS1 dsRNA、LmCHS1A dsRNA、LmCHS1B dsRNA和LmCHS2dsRNA组的死亡率分别为95%、88%、51%和95%,与注射buffer和dsGFP的对照组相比(死亡率为5%和0%),差异显著。通过检测几丁质合成酶基因的mRNA表达,均发现目标基因mRNA的表达量显著下降而非靶标基因的表达不受影响。上述结果表明,几丁质合成酶对东亚飞蝗的生长发育有着至关重要的作用,基因沉默可直接导致东亚飞蝗的发育受阻甚至死亡。