具有clip结构域的丝氨酸蛋白酶（clip domain serine protein,c SP）在甲壳动物天然免疫体系中发挥着重要作用,然而该蛋白酶在同一物种中不同c SP功能的比较研究较少,更是缺乏对免疫信号调节作用的研究。可变淋巴受体基因（variable lymphocyte receptors,VLRs）是脊索动物七鳃鳗（Petromyzon marinus）获得性免疫的分子基础,近年来已有报道VLRs在无脊椎动物的适应性免疫防御中发挥独特作用。本研究基于基因克隆、原核系统蛋白表达、RNA干扰、实时定量PCR等分子生物学实验技术对3个三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）clip结构域丝氨酸蛋白酶（PtcSP1、PtcSP2、PtcSP3）进行了免疫功能比较分析,探讨了PtcSPs与其他免疫基因间的调控关系,并对中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）可变淋巴受体（EsVLRA）进行了结构分析及免疫致敏效应的研究,从先天免疫和免疫致敏两个维度分别研究了PtcSPs基因在蛋白水平的功能多样性以及EsVLRA的免疫记忆性。本文主要研究内容及结果如下:PtcSPs-C的序列比对结果显示,PtcSP1、PtcSP3具有胰蛋白酶所特有的Asp189、Gly216和Gly226位点,而PtcSP2在底物结合口袋位点序列则更为多样,进化树分析结果表明,PtcSP2与胰凝乳蛋白酶聚为一枝。经原核重组蛋白表达系统,分别重组表达了三疣梭子蟹PtcSPs的SP结构域（PtcSPs-C）和clip结构域（PtcSPs-N）。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性验证实验进一步证明,重组表达复性的PtcSP1、PtcSP3具有胰蛋白酶活性,而复性的重组蛋白PtcSP2具有胰凝乳蛋白酶活性。PtcSP1、PtcSP3的clip结构域（PtcSPs-N）对测试的革兰氏阴性（铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和溶藻弧菌Vibrio alginolyticus）和革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和藤黄微球菌Micrococcus luteus）菌具有抑制作用。值得注意的是,PtcSP1、PtcSP3抗菌特性有所不同,r PtcSP1-N对革兰氏阳性菌藤黄微球菌的抗菌活性最高（MIC值小于0.99μM）,r PtcSP3-N则对革兰氏阴性菌溶藻弧菌的生长（MIC值小于0.58μM）表现出最强抗菌活性。然而,并没有观察到重组蛋白针对酵母的明显的抗菌活性,也未检测到明显的PtcSP1-C和PtcSP3-C的抗菌活性。此外,菌结合试验中发现,r PtcSP1-N和r PtcSP3-N均对检测的革兰氏阴性菌（P.aeruginosa和V.alginolyticus）革兰氏阳性菌（S.aureus和M.luteus）以及真菌（毕赤酵母菌Pichia pastoris）表现出菌结合活性。菌清除试验结果表明,PtcSP1具有溶藻弧菌的菌清除活性并呈现时间依赖性响应模式,暗示PtcSP1可能作为调理素参与免疫反应。三疣梭子蟹PtcSP1、PtcSP2基因沉默后,除抗脂多糖因子5（Pt ALF5）之外,其他Pt ALFs表达均受到抑制,而PtcSP3沉默后所有检测的Pt ALFs表达均受到抑制,提示PtcSPs调控Pt ALFs合成的多样性;PtcSP1和PtcSP3的沉默可上调补体样相关分子的表达,暗示丝氨酸蛋白酶基因与补体样基因之间的拮抗关系。此外,PtcSP2基因沉默后机体酚氧化酶（Phenoloxidase,PO）活性并未受到影响与PO激活相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂相关基因表达也未受到明显干扰,而PtcSP1和PtcSP3的低表达则使机体内PO活性明显降低。中华绒螯蟹EsVLRA的ORF长度为2400 bp,编码一个799个氨基酸长的蛋白。包括一个LRR＿NT结构域,十三个LRRs结构域和一个LRR＿CT结构域,同时,在其C末端发现了一个明显的凸出环结构。氨基酸序列的多序列比对分析表明,EsVLRA具有与其他物种VLRA一致保守的氨基酸序列组成;系统发育分析表明,EsVLRA被归为VLRA一类,说明中华绒螯蟹中的VLR是VLRAs家族的新成员。在所有检测的血细胞、心脏、肌肉、肝胰腺、腮和性腺组织中都检测到EsVLRA的m RNA表达,其中,在肝胰腺、性腺和鳃中具有高表达水平;值得注意的是,EsVLRA在雄性蟹的肝胰腺、性腺、鳃和脑中的表达明显高于雌性。重组表达的rEsVLRA可以与革兰氏阴性菌副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和铜绿假单胞菌,革兰氏阳性菌藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌以及毕赤酵母强烈结合,但并没有显示出任何抗菌活性,说明EsVLRA主要作为一种病原微生物的受体参与免疫识别。免疫致敏试验中,发现健康蟹经过甲醛灭活的副溶血弧菌刺激时首先在第3小时表现出显著升高（P<0.05）;在第二次注射活菌后,EsVLRA的表达在注射后的第1小时便显著上调,并且比第一次注射时表达量高得多（约为第一次峰值的50倍,P<0.01）;最高的表达水平出现在第二次攻击后的第6小时（约为第一次峰值的240倍,P<0.01）,这种显著的高表达水平还一直持续到第48小时（P<0.01）。表明EsVLRA可能对于病原刺激具有记忆性。对三疣梭子蟹3丝氨酸蛋白酶的免疫功能研究表明,它们具有丰富多样的免疫活性。研究认为PtcSPs可分别通过抗菌活性,病原微生物识别,调理素介导的细胞免疫,酚氧化酶原激活反应介导的体液免疫以及调控其他先天免疫基因等多个方面在甲壳动物先天免疫中执行免疫抵御功能。对中华绒螯蟹免疫致敏相关基因可变淋巴受体的研究表明,EsVLRA在结构上与七鳃鳗中的VLRA具有较高相似性,在功能上作为模式识别受体参与到甲壳动物的免疫致敏过程中。综上,本研究丰富了丝氨酸蛋白酶的多样性免疫功能的理论基础,同时为甲壳动物的免疫致敏现象研究提供了新的研究线索。