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目的:非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是一种临床疾病状态,其特征在于在没有大量饮酒或其他已知慢性肝病原因的个体中,组织学检测发现肝细胞有5%或更高的大泡性脂肪变性。NAFLD发病率高,危害性大,目前尚无有效的治疗手段。在NAFLD发病过程中,肝脏脂肪酸代谢稳态失衡是最关键的环节。肝脏中脂肪酸有三个主要来源:食物摄取,脂肪组织分解,从头合成;同时有四个去向:β-氧化,合成极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein,VLDL）分泌到肝外,合成甘油三酯（triglyceride,TG）储存,合成其他脂质。肝细胞中受损的线粒体脂肪酸氧化（fatty acid oxidation,FAO）会导致脂质过度积累和活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的产生以及氧化损伤,是形成非酒精性脂肪肝的重要机制。脂肪酸转位酶（Fatty acid translocase,cluster of differentiation 36,FAT/CD36）是一种促进长链脂肪酸（Long chain fatty acid,LCFA）摄取的跨膜糖蛋白,在多种细胞表面都有表达。肝脏FAT/CD36的表达与NAFLD的发生发展呈正相关。最近研究发现FAT/CD36与脂肪酸氧化也有关系,这超出了其摄取LCFA的功能。FAT/CD36的功能与其在细胞中的定位有关,有研究发现在骨骼肌细胞的线粒体中也存在FAT/CD36,并且与运动时肌肉收缩耗能相关。蛋白质棕榈酰化修饰是一种可逆的翻译后脂质修饰,通常被认为可以调节蛋白质的亚细胞定位。我们前期研究发现FAT/CD36棕榈酰化修饰可增加肝细胞FAT/CD36在细胞膜的分布并促进脂肪酸摄取,导致肝脏脂肪变性。FAT/CD36去棕榈酰化修饰后一方面可以减少脂肪酸摄取,另一方面还可以促进线粒体脂肪酸氧化,然而其具体机制有待进一步研究。在本课题中,我们旨在探讨FAT/CD36棕榈酰化修饰对其在线粒体定位中的影响及其在肝细胞脂肪酸氧化中的作用,为NAFLD的防治提供实验依据。方法:第一部分:肝脏FAT/CD36蛋白棕榈酰化修饰情况与NAFLD的关系。（1）给予8周龄雄性C57BL/6J小鼠喂食高脂饮食（high-fat diet,HFD）16周,同时以正常饲料（normal chow diet,NCD）喂养小鼠16周作为对照,以构建NAFLD小鼠模型。用苏木素-伊红（haematoxylin＆eosin,HE）染色观察小鼠肝脏病理变化,并用试剂盒检测小鼠肝脏TG含量。免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）和免疫印迹（western blotting,WB）分析检测小鼠肝脏中的FAT/CD36表达水平。使用树脂辅助捕获S-酰化蛋白（resin-assisted capture of S-acylated proteins,Acyl-RAC）结合免疫印迹评估NCD或HFD小鼠肝脏中FAT/CD36的棕榈酰化修饰水平。（2）将含有野生型FAT/CD36（WT-CD36）或棕榈酰化位点突变的FAT/CD36（AA-SS）或空载的（NC）的腺相关病毒载体AAV2/8（Adreno-Associated Virus,AAV）通过小鼠尾静脉注入FAT/CD36-KO小鼠并以高脂喂养8周。HE染色观察小鼠肝脏病理变化,用试剂盒检测小鼠肝脏TG含量。用含有WT-CD36和AA-SS的慢病毒载体在Hep G2和Huh7细胞中构建过表达野生型FAT/CD36（WT-CD36）或棕榈酰化位点突变的FAT/CD36（AA-SS）的稳定细胞系。Bodipy染色观察细胞内脂滴堆积情况。（3）用试剂盒检测小鼠肝脏中还原型谷胱甘肽（reduced glutathione,GSH）与氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione disulfide,GSSG）的比率（GSH/GSSG）以及细胞中活性氧ROS的水平。线粒体呼吸链复合物I-IV的活性也用试剂盒检测。第二部分:FAT/CD36棕榈酰化修饰对其在肝细胞线粒体定位和功能的影响（1）用免疫印迹分析细胞中CPT1A的表达情况。试剂盒检测细胞匀浆中CPT1活性和FAS活性。荧光定量PCR检测小鼠肝脏中ACC和FAS的m RNA水平。LC-MS检测小鼠肝脏中丙二酰辅酶A（malonyl Co A）的含量。（2）线粒体蛋白被分离并用免疫印迹分析总蛋白和线粒体蛋白中FAT/CD36的含量。免疫荧光染色FAT/CD36与线粒体共定位情况。用胶体金标记FAT/CD36,在电子显微镜下观察FAT/CD36在线粒体的定位情况。（3）通过液相色谱质谱联用仪（liquid Chromatograph Mass Spectrometer,LC-MS）检测Hep G2细胞中脂肪酸代谢中间产物酰基辅酶A和酰基肉碱的含量。（4）运用Seahorse XFe24分析仪检测肝细胞中不同底物（棕榈酸酯或棕榈酰辅酶A）的线粒体氧耗。第三部分:减少FAT/CD36棕榈酰化修饰促进肝细胞脂肪酸氧化的具体机制（1）细胞内总蛋白和线粒体蛋白被分离并用WB检测长链酰基辅酶A合成酶（long-chain acyl-Co A synthetases,ACSL）各亚型的表达。用胶体金标记ACSL1,在电子显微镜下观察小鼠肝脏线粒体ACSL1的定位含量情况。用荧光定量PCR检测细胞内ACSL1的转录水平。在WT-CD36和AA-SS-Hep G2细胞中用放线菌酮（cycloheximide,CHX）（50μg/ml）处理不同时间（0、6、12、18和24小时）,收取总细胞裂解液,用WB分析ACSL1的半衰期。将ACSL1-si RNA转染到Hep G2细胞并检测细胞中棕榈酸为底物的线粒体氧耗情况。（2）免疫荧光染色观察FAT/CD36与ACSL1共定位情况。免疫共沉淀（Coimmunoprecipitation,CO-IP）分析FAT/CD36和ACSL1之间的相互作用。原位邻近连接测定法（proximity ligation assay,PLA）进一步验证FAT/CD36和ACSL1之间的相互作用。（3）用绿色的BODIPY C16（一种与BODIPY荧光团结合的脂肪酸类似物）处理细胞,追踪脂肪酸与线粒体的定位关系。将AA-SS-K164A突变体（AA-SS-CD36的赖氨酸残基164（Lys-164）被丙氨酸取代,使FAT/CD36失去脂肪酸结合活性）转染到Hep G2细胞中,检测细胞内总蛋白和线粒体蛋白中FAT/CD36表达情况,以棕榈酸为底物检测细胞内线粒体氧耗。结果:第一部分:肝脏FAT/CD36蛋白棕榈酰化修饰情况与NAFLD的关系。（1）与正常饲料（NCD）喂养的小鼠相比,高脂饮食（HFD）喂养的C57BL/6J小鼠出现典型的肝细胞气球样变并且肝脏TG含量增加。喂食HFD的小鼠肝脏中的FAT/CD36表达水平显着增加。树脂辅助捕获S-酰化蛋白（Acyl-RAC）结合WB结果表明FAT/CD36的棕榈酰化修饰水平在喂食HFD小鼠中增加。（2）与高脂喂养的过表达野生型FAT/CD36（WT-CD36）小鼠相比,高脂喂养的棕榈酰化位点突变的FAT/CD36（AA-SS）小鼠的肝脏脂质积累和TG含量显着降低。此外,在过表达WT-CD36和AA-SS的稳定Hep G2细胞系中,棕榈酸诱导的脂滴积累在AA-SS-Hep G2细胞中减少。用棕榈酰化抑制剂2-溴棕榈酸酯（2BP）处理也减少了Hep G2细胞中的脂滴积聚。（3）与NCD喂养的小鼠相比,在HFD喂养引起的NAFLD模型小鼠肝脏中,GSH/GSSG的比率以及还原型谷胱甘肽的含量降低。与WT-CD36小鼠相比,GSH/GSSG比率和肝脏中还原型谷胱甘肽的含量在FAT/CD36棕榈酰化位点突变小鼠（AA-SS小鼠）中增加。此外,与WT-CD36-Hep G2细胞相比,AA-SS-Hep G2细胞中的ROS产生减少,线粒体呼吸链复合物I-IV的活性增加。第二部分:FAT/CD36棕榈酰化修饰对其在肝细胞线粒体定位和功能的影响（1）脂肪酸氧化限速酶CPT1A的蛋白表达含量在WT-CD36和AA-SS组没有明显变化,而CPT1A的活性在AA-SS细胞中增加。与WT-CD36小鼠相比,AA-SS小鼠肝脏ACC和FAS的m RNA水平降低。AA-SS-Hep G2细胞中的FAS活性也降低。此外,丙二酰辅酶A的含量在AA-SS小鼠肝脏中也降低。这些数据表明,减少FAT/CD36棕榈酰化修饰可以上调肝脏脂肪酸氧化能力并减少肝脏脂肪生成。（2）在FAT/CD36棕榈酰化位点突变细胞（AA-SS）和用棕榈酰化抑制剂2-溴棕榈酸酯（2BP）处理的肝细胞中,FAT/CD36在线粒体的表达量增加,而FAT/CD36的总表达在各组之间保持不变。此外,共聚焦显微镜分析表明,与WT-CD36组相比,在Hep G2和Huh7细胞的AA-SS组,FAT/CD36和线粒体的共定位显着增加。同样,在AA-SS小鼠中,FAT/CD36和线粒体的共定位比WT-CD36组显着增加。胶体金免疫标记FAT/CD36后,通过电子显微镜分析观察证实FAT/CD36在AA-SS-Hep G2细胞的线粒体膜上定位增多。这些数据表明FAT/CD36存在于肝细胞的线粒体膜上,并且FAT/CD36棕榈酰化的减少显着促进了FAT/CD36定位到线粒体。（3）质谱结果显示WT-CD36和AA-SS组之间的脂肪酸氧化的关键中间产物存在明显差异。总的短/中链酰基辅酶A（C2-C10）含量在AA-SS组降低,而总长链酰基辅酶A（C12-C20）的含量在AA-SS组中增加。其中,短/中链酰基辅酶A的减少以C3、C4、C5和C6酰基辅酶A为主,长链酰基辅酶A的增加主要是C16、C18和C20酰基辅酶A。一致地,AA-SS组中总酰基肉碱的含量增加,其中C16、C18和C20酰基肉碱水平显着增加。这些结果表明减少FAT/CD36棕榈酰化促进了肝细胞中长链酰基辅酶A和酰基肉碱的产生。（4）与WT-CD36组相比,当使用棕榈酸酯作为底物时,AA-SS组的线粒体耗氧量（OCR）、最大呼吸量和ATP产量更高。以棕榈酰辅酶A为底物时,线粒体氧耗量（OCR）,最大呼吸量和ATP产量在两个组没有变化。减少FAT/CD36棕榈酰化修饰会增加棕榈酸酯为底物的OCR,但不会增加棕榈酰辅酶A为底物的OCR,这表明FAT/CD36对脂肪酸氧化的影响位于产生酰基辅酶A的上游。第三部分:减少FAT/CD36棕榈酰化修饰促进肝细胞脂肪酸氧化的具体机制（1）ACSL是细胞内合成长链酰基辅酶A的关键酶,与WT-CD36组相比,AA-SS-Hep G2细胞和AA-SS小鼠肝脏中的ACSL1的细胞内总含量增加,而ACSL3-6的细胞内总表达水平在两组之间无明显差异。同样的,与WT-CD36组相比,AA-SS细胞和小鼠肝脏中的ACSL1的线粒体含量增加,ACSL3-6的线粒体表达水平在两组之间没有显着差异。ACSL1的m RNA水平在WT-CD36和AA-SS两组中没有差异,但在AA-SS细胞中观察到ACSL1蛋白的延迟降解,表明FAT/CD36棕榈酰化减少后可能在转录后水平调节ACSL1表达。用ACSL1-si RNA转染Hep G2细胞降低了ACSL1的表达。AA-SS-Hep G2细胞中的ACSL1的敲低显着降低了棕榈酸酯依赖性的线粒体氧耗、最大呼吸量和ATP的产生。这说明ACSL1是去棕榈酰化修饰的FAT/CD36促进线粒体脂肪酸β-氧化所必需的蛋白。（2）共聚焦显微镜分析显示,与WT-CD36组相比,AA-SS细胞中FAT/CD36和ACSL1的共定位增加。免疫共沉淀分析结果表明,减少FAT/CD36棕榈酰化促进了FAT/CD36和ACSL1之间的相互作用。PLA结果显示,与WT-CD36细胞相比,AA-SS细胞表现出更强的阳性荧光信号,进一步说明FAT/CD36棕榈酰化的减少促进了FAT/CD36和ACSL1之间的相互作用。（3）用带绿色荧光的脂肪酸追踪细胞内脂肪酸与线粒体定位的结果显示,减少FAT/CD36棕榈酰化会增加脂肪酸向线粒体的运输。将AA-SS-K164A突变体（AA-SS-CD36的赖氨酸残基164（Lys-164）被丙氨酸取代,使CD36失去脂肪酸结合活性）转染到Hep G2细胞中,与AA-SS细胞相比,细胞内总的FAT/CD36和线粒体FAT/CD36表达水平不变。AA-SS-K164A细胞中脂肪酸向线粒体运输较AA-SS细胞中减少。棕榈酸为底物的线粒体氧耗检测显示:AA-SS-K164A细胞中线粒体氧耗,最大呼吸量和ATP产量较AA-SS细胞降低。这些数据表明线粒体上去棕榈酰化的FAT/CD36仍然具有转运脂肪酸的作用,并且FAT/CD36的Lys-164位点仍然是结合脂肪酸的关键位点,FAT/CD36可以将脂肪酸转运给ACSL1,促进LCFA和线粒体之间的接触,由此促进脂肪酸氧化。结论:减少FAT/CD36棕榈酰化修饰可以促进肝细胞线粒体中的脂肪酸β-氧化,减轻NAFLD小鼠肝脏的脂质积聚。FAT/CD36棕榈酰化修饰的减少促进FAT/CD36向线粒体的分布增多,FAT/CD36与ACSL1相互作用并作为分子桥梁将LCFA转运给ACSL1,从而产生更多的酰基辅酶A,随后进入线粒体进行β-氧化。由于棕榈酰化修饰控制FAT/CD36的分布和功能,靶向FAT/CD36的棕榈酰化修饰位点可能成为治疗NAFLD及其他代谢性疾病的潜在策略。