研究背景与目的糖尿病角膜神经损伤是糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy,DPN）的一部分,在糖尿病（diabetes mellitus,DM）早期即可出现。但是受检查设备——角膜共焦显微镜（corneal confocal microscopy,CCM）——观察视野小和定位功能差的限制,其病情评估往往存在较大偏差,无法形成统一的诊断阈值;另一方面,糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）作为糖尿病在眼部最严重的的并发症,其全视网膜光凝（panretinal photocoagulation,PRP）治疗是否会对角膜神经造成进一步的损伤,目前国内外尚未达成共识。因此,亟需对CCM检查技术进行改进,以弥补检查设备的局限性,提高检测的准确性和可靠性,从而突破当前研究的瓶颈。本研究的目的就是通过对CCM检查技术进行改进,并将标准的单张图像合成为角膜上皮基底神经丛（subbasal nerve plexus,SNP）结构拼图,在此基础上对神经参数进行量化分析,评估DM和PRP治疗对SNP的影响,并探讨其可能的病理机制,为临床预防和治疗相关眼表疾病提供理论依据。研究方法:1.正常人SNP结构拼图的构建:募集年龄在20～30岁的健康志愿者30人作为研究对象,所有受试者经过筛查排除影响神经功能的全身和局部病变后纳入研究,均选择右眼为受检眼,使用海德堡Ⅱ代激光断层扫描系统（Heidelberg Retinal Tomograph Ⅱ,HRT-Ⅱ）采集涡状结构周围2～3mm的区域的SNP图像;所得的单张图像用Adobe Photoshop图像处理软件拼接;之后由两名经验丰富的眼科医生先分别在标准单张图像中选择3张有代表性的、图像清晰完整的、无重叠区域的涡状区单张图像,再分别在拼图上选择以涡状结构为中心的、大小为700μm×700μm的裁剪图,使用Image J半自动图像分析系统进行图像分析。使用重复性系数（coefficient of repeatability,CoR）和Bland-Altman分析分别评估传统的多张标准图像分析法和拼图法观察者间的一致性,从而验证拼图法在SNP定量分析中的应用价值。2.DR患者SNP特征分析:收集就诊于山西省眼科医院门诊、年龄50～65岁的2型糖尿病患者,按照病情分为无糖尿病视网膜病变组（non-diabetic retinopathy,NDR）、非增殖期糖尿病视网膜病变组（non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR）和增殖期糖尿病视网膜病变组（proliferative diabetic retinopathy,PDR）,同时纳入年龄与性别匹配的年龄相关性白内障患者作为对照组。所有受检者均接受CCM检查,观察涡状区SNP形态,并测量神经纤维长度（nerve fiber length,NFL）。采用协方差分析和Spearman秩相关分析探讨DR分期与糖尿病角膜神经损伤的相关性。3.PRP对DM患者SNP的影响及其机制探讨:选取准备行PRP治疗、年龄50～65岁、双眼DR Ⅳ期的2型糖尿病患者,根据随机数字法分为水平径线激光组和垂直径线激光组。所有患者均选择病情较重眼为治疗眼,对侧眼为对照眼。分别于PRP治疗前、每次光凝后1周和PRP完成后1个月行CCM检查观察涡状结构周围2～3mm的区域的SNP和朗格汉斯细胞（langerhans cell,LC）形态,并测量涡状区NFL和LC密度;于PRP治疗前和PRP完成后1个月行OCT检查测量黄斑区脉络膜厚度。采用重复测量方差分析、SAS软件的MIXED模型和Pearson相关分析探讨PRP对SNP的影响及其相关机制。结果1.按照独立设计的检查规范结合文献报道的方法成功构建了 30名受试者的SNP神经结构拼图。所有受检眼均可于角膜中央偏鼻下方查见涡状结构。拼图法两名医生所选的涡状区图像SNP形态较一致,一致性参数分析示观察者间CoR为3.79%,Bland-Altman散点图示观察者间NFL差值均聚集于“0”刻度线附近,95%一致性区间（limit of agreement,LOA）较窄,一致性良好;而传统的标准多张图像分析法二者所选涡状区三张图像差异较大,一致性参数分析示观察者间CoR为11.65%,Bland-Altman散点图示观察者间NFL差值分布较分散,95%LOA较宽,一致性相对较差。2.与正常对照组相比,糖尿病各组涡状区神经纤维普遍变细、密度下降,走行迂曲,并伴有不同程度的涡状结构缺失。NDR组和NPDR组主要表现为涡状中心缺失;PDR组除涡状中心缺失外,部分受检眼还合并下方及颞侧的结构缺失。对照组 NFL 值为 21.08±4.74mm/mm2,NDR 组为 16.47±6.35mm/mm2,NPDR 组为 14.95±3.90mm/mm2,PDR 组为 11.61±3.24mm/mm2。组间比较差异具有统计学意义（F=10.54,P<0.001）。NDR组与PDR组NFL值比较差异具有统计学意义（P=0.008）,而NDR组与NPDR组及NPDR组与PDR组NFL比较差异均无统计学意义（分别为P=0.359和P=0.075）。Spearman秩相关分析分析显示,NFL值与DR分期呈明显负相关（r=-0.582）。3.PRP治疗后部分患者出现SNP神经纤维变细、密度下降,伴有不同程度的神经结构缺失。治疗眼各观察时间点NFL值整体比较差异具有统计学意义（F=4.241,P=0.010）。水平径线组在第1次光凝后和第2次光凝后均有病例出现SNP神经纤维密度下降,各观察时间点NFL值总体比较差异具有统计学意义（F=7.192,P<0.001）,其中,PRP治疗前与第1次光凝后1周、第2次光凝后1周以及PRP完成后1个月比较NFL值差异均具有统计学意义（均为P<0.05）;垂直径线组在第3次光凝后和第4次光凝后均有病例出现SNP神经纤维密度下降,但各观察时间点NFL值总体比较差异无统计学意义（F=1.436,P=0.245）。PRP治疗后LC密度增加,并为以涡状区为中心聚集,且成熟LC浸润区可见SNP神经结构的缺失。各观察时间点LC密度整体比较异具有统计学意义（F=14.640,P<0.001）,其中PRP治疗前与第2次光凝后1周、第3次光凝后1周、第4次光凝后1周以及PRP完成后1个月比较LC密度差异均具有统计学意义（均为P<0.05）;水平径线组与垂直径线组各观察时间点LC密度总体比较差异无统计学意义（F 分组×时间=0.001,P 分组×时间=0.971）;各观察时间点未成熟LC密度总体比较差异具有统计学意义（F=17.800,P<0.001）,而成熟LC密度总体比较差异无统计学意义（F=1.200,P=0.290）。相关分析显示PRP完成后整体LC密度和未成熟LC密度均与其相应基线水平呈明显正相关（分别为r 整体LC=0.674,P<0.001;r未成熟LC=0.712,P<0.001）,而成熟LC密度与基线水平无明显相关性（r 成熟LC=0.187,P=0.152）。NFL值与LC密度呈负相关关系（ρ=-0.041）。PRP治疗前后NFL差值与基线脉络膜厚度和PRP治疗前后脉络膜厚度差值之间均无明显相关性（分别为r 基线=-0.009,P=0.946;r 差值=0.007,P=0.960）。结论1.按照特定的检查规范,在解决图像定位、连续采集和图像质量控制等技术问题的前提下,在不额外添加任何硬件和软件的条件下,可以利用现有的角膜CCM检查设备,成功构建SNP结构拼图;2.拼图法能够提供更大的观察视野,使研究者获取更多的SNP形态学信息,并且可以针对同一区域进行重复测量,其对神经参数评估的一致性也明显优于传统的多张标准图像分析法。3.DM患者SNP神经纤维普遍变细、密度下降,走行迂曲,并伴有不同程度的神经结构缺失;且神经结构的缺失首先从其涡状中心开始,逐渐向其下方和颞侧发展;4.DM患者SNP神经损伤早于DR出现,在DR病变过程中呈逐渐发展的趋势;且NFL值与DR病情严重程度呈明显的负相关。5.PRP治疗可以导致DR患者SNP损伤,表现为神经纤维变细、密度下降,伴有不同程度的神经结构缺失;6.水平径线光凝容易导致SNP损伤的结果,支持PRP通过热传导损伤睫状后长神经,进而影响角膜SNP的推论;7.PRP治疗后LC密度增加,成熟LC浸润区可见SNP神经结构的缺失的结果,支持免疫机制参与介导PRP治疗后角膜神经损伤的理论。