第一部分实验性蛛网膜下腔出血后早期大鼠COMT表达的变化及意义目的观察实验性SAH后早期大鼠COMT的mRNA和蛋白表达、血浆CA含量、基底动脉管径和管壁厚度的变化规律,探讨SAH后早期大鼠COMT表达变化的意义。方法以视交叉前池单次注血法构建大鼠SAH模型。采用RT-PCR法、Western Blotting法检测大鼠SAH后早期各个时相点(SAH后6h、12h、24h、48h、72h)纹状体组织内COMT的mRNA和蛋白表达。采用高效液相色谱法测定大鼠相应时相点血浆CA含量。HE染色后测量大鼠相应时相点基底动脉管径和管壁厚度。结果假手术组大鼠COMT的mRNA和蛋白表达与正常对照组比较无统计学差异(P＞0.05)。与正常对照组和假手术组比较,SAH组大鼠在建模后6h见COMT的mRNA和蛋白表达开始增高(P＜0.01),12h时达到高峰(P＜0.01),24h后开始下降(P＜0.01),48h时仍高于正常对照组和假手术组相应时相点水平(P＜0.01)。至建模后72h时接近正常水平,与正常对照组和假手术组相应时相点比较差异无统计学意义(P＞0.05)。假手术组大鼠血浆CA含量与正常对照组比较无统计学差异(P＞0.05)。SAH组大鼠在建模后6h即见血浆CA含量升高,24h时达到峰值,24h后开始下降,至72h后仍高于正常对照组和假手术组相应时相点水平。各时相点CA含量与正常对照组和假手术组相应时相点比较均有统计学差异(P＜0.01)。假手术组大鼠基底动脉的管径和管壁厚度与正常对照组比较无统计学差异(P＞0.05)。与正常对照组和假手术组比较,SAH组大鼠在建模后6h基底动脉的管径开始缩小,管壁开始增厚,但变化无统计学差异(P＞0.05);建模后12h,基底动脉的管径缩小和管壁增厚进一步加重(P＜0.01),至建模后24h最明显(P＜0.01)并持续至建模后48h(P＜0.01);建模后72h,基底动脉的管径和管壁厚度已接近正常大小(P＞0.05)。结论(1)实验性SAH可以诱导SAH后早期大鼠纹状体COMT表达增高。(2)实验性SAH后早期CA含量明显升高并伴有CVS发生。(3)SAH后早期CVS和血浆CA含量增高可能与SAH后早期COMT表达增高不够充分和持久有关。第二部分pAdxsi-GFP-rCOMT重组腺病毒载体的构建、包装、扩增、纯化目的构建Ad-GFP-rCOMT重组腺病毒载体体系,为研究COMT基因转染提供材料。方法扩增得到目的基因片段克隆到pGEM-T Easy Vector上,得到rCOMT-T克隆载体。从rCOMT-T克隆载体上EcoRI酶切得到rCOMT基因,连接到pShuttle-GFP-CMV载体,得到pShuttle-GFP-rCOMT。将pShuttle-GFP-rCOMT转移至pAdxsi载体上,得到Ad-GFP-rCOMT病毒质粒。Ad-GFP-rCOMT质粒经PacⅠ酶切、酚氯仿抽提、乙醇沉淀后,脂质体介导转染293-T细胞。将重组腺病毒大量扩增,然后用CsCl密度梯度超离心法进行纯化,加入10%灭菌甘油,分装后-80℃保存备用。结果酶切和PCR鉴定证明rCOMT-T克隆载体质粒、重组穿梭载体质粒和重组腺病毒载体质粒完全正确,并能在293-T细胞中融合表达。结论成功构建Ad-GFP-rCOMT重组腺病毒载体体系,并成功转染293-T细胞,为研究COMT基因转染奠定了基础。第三部分pAdxsi-GFP-rCOMT重组腺病毒转染对SAH大鼠COMT表达的影响目的探讨基因转染对实验性SAH后早期大鼠COMT表达、血浆CA含量及基底动脉管径和管壁厚度的影响。方法以视交叉前池单次注血法构建大鼠SAH模型。建模后即刻采用立体定向技术在SAH模型大鼠的纹状体内注射pAdxsi-GFP-rCOMT重组腺病毒。采用RT-PCR法、Western Blotting法检测转染后各个时相点(转染后6h、12h、24h、48h、72h)纹状体组织内COMT的mRNA和蛋白表达。采用高效液相色谱法测定大鼠相应时相点血浆CA含量。HE染色后测量大鼠相应时相点基底动脉管径和管壁厚度。结果转染后6h腺病毒注射组大鼠纹状体组织中COMT的mRNA和蛋白表达开始增高,但与SAH组、空载体注射组比较无明显统计学差异(P＞0.05)。自转染后12h开始COMT的mRNA和蛋白表达增强更加明显,于24h时达到峰值,24h后开始下降直至转染后72h,各时相点表达水平均明显高于SAH组和空载体注射组相应时相点水平(P＜0.01)。腺病毒注射组大鼠血浆CA含量在转染后6h开始增高,但与SAH组、空载体注射组比较无明显统计学差异(P＞0.05)。自转染后12h开始血浆CA含量升高更加明显,并于转染后24h达到高峰,转染后24h开始下降,至48h时下降更加明显,至72h时已降至接近正常水平,各时相点CA含量与SAH组和空载体注射组相应时相点水平比较均有明显降低(P＜0.01)。腺病毒注射组大鼠在转染后6h基底动脉的管径开始缩小,管壁开始增厚,但与SAH组和空载体注射组比较变化无统计学差异(P＞0.05)。转染后12h,基底动脉的管径缩小和管壁增厚进一步加重,至转染后24h最明显并持续至48h,但各时相点与SAH组和空载体注射组相应时相点比较均有明显改善(P＜0.01)。转染后72h,基底动脉的管径缩小和管壁增厚明显缓解接近正常大小(P＞0.05)。结论(1)pAdxsi-GFP-rCOMT重组腺病毒可明显增强转染后早期(转染12h后)各个时相点COMT表达水平,且高表达持续时间更长。(2)与SAH组和空载体注射组比较,转染12h后各时相点血浆CA含量明显下降,CVS明显缓解。(3)转染后血浆CA含量下降及CVS缓解可能与重组腺病毒所诱导的COMT表达进一步增强有关。(4)再次证实了实验性SAH后早期CVS和血浆CA含量增高与SAH后早期COMT表达增高不够充分和持久的相关性。第四部分COMT基因多态性与SAH后早期CVS的相关性分析目的探讨COMT基因多态性与SAH后早期CVS的相关性。方法搜集重庆医科大学附属第一院神经外科2008年1月至2008年12月收治的自发性SAH急性期(＜3d)患者167例,采集静脉血,记录临床资料。运用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)技术分析SAH患者COMT基因型及等位基因频率。运用TCD判定SAH患者早期CVS的严重程度。运用Hunt-Hess分级评估患者病情严重程度。运用头颅CT的Fisher分级评估出血量的多少。采用x~2检验和Logistic回归分析等方法(SPSS13.0软件)分析COMT基因分型结果等临床资料与CVS的相关性。结果各等位基因分布符合Hardy—Weinberg定律,研究样本为遗传平衡群体。A等位基因携带者的CVS发生率(51.7%)明显高于G等位基因携带者(38.5%)。A/A基因型患者CVS发生率(66.7%)明显高于G/G(35.9%)。单因素Logistic回归分析提示A等位基因、A/A基因型和Hunt&Hess分级3-5级与CVS具有相关性。调整临床相关因素后,多因素Logistic回归仍提示A等位基因、A/A基因型是SAH后早期CVS的危险因素。结论:COMT-A等位基因、A/A基因型是SAH后早期CVS的危险因素。