论文部分内容阅读
研究背景食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)患者五年生存率仍然低于20%,放射治疗是ESCC患者一项重要的治疗方法。最近,有研究表明活化地肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)与ESCC患者的差的预后及同步放化疗后局部复发密切相关。越来越多的研究亦显示放射线可以通过作用肿瘤间质微环境影响肿瘤发生发展,由此丰富了放射线诱发肿瘤的证据。近几年来肝癌衍生生长因子(Hepatoma-derived growth factor, HDGF)引起了学术界广泛关注,它既是具有促成纤维细胞有丝分裂活性的酸性多肽,也与多种肿瘤差的预后密切相关：同时其表达变化与多种肿瘤的转化、凋亡、血管生成以及转移密切相关。HDGF与ESCC患者的放疗敏感性以及肿瘤复发亦有紧密联系。CAFs与肿瘤转移的多种信号转导通路相关联,包括可以促进肿瘤细胞的上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)过程,而大量研究表明EMT可以赋予细胞迁移、侵袭能力以及诱导干细胞特性。并且已有多篇文献证明间质成纤维细胞可以通过EMT促进肿瘤细胞侵袭与转移。与此同时,最近越来越多的研究表明γ射线源照射成纤维细胞可以通过肿瘤间质相互作用促进肿瘤发生以及侵袭生长。而X射线源照射成纤维细胞是否促进ESCC侵袭转移及其机制尚有待于进一步研究。目的1.本实验旨在研究X射线对间质成纤维细胞的作用以及照射后CAFs对ESCC细胞的影响。2.探讨在放射线对ESCC与间质成纤维细胞相互作用中的EMT相关蛋白以及HDGF表达变化。方法1.我们分离及培养原代CAFs和正常成纤维细胞(Normal Fibroblasts, NFs)来研究ESCC肿瘤微环境内的间质成纤维细胞特点。为了证明CAFs没有其他细胞成分混杂及其纯度,利用成纤维细胞标记蛋白纤连蛋白(fibronectin)区分成纤维细胞与ESCC细胞。Western blotting验证原代成纤维细胞高表达a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)和不表达E-钙粘蛋白(E-cadherin),体现原代成纤维细胞的细胞特性。2.在室温条件下,用X射线源以不同剂量照射原代成纤维细胞,剂量率为400cGy/min。照射后收集条件培养液留待后续培养ESCC细胞试验用。3.采用侵袭实验检测与照射后(4Gy和8Gy)或未照射成纤维细胞(NFs和CAFs)共培养的ESCC细胞的侵袭能力。4.采用Scattering实验检测照射后成纤维细胞的条件培养液对ESCC细胞的Scattering能力的影响。5. ESCC细胞和4Gy照射后成纤维细胞或未照射成纤维细胞均匀混合后种植于裸鼠右背侧皮下,每组六只。每3天用游标卡尺测量肿瘤大小一次并记录,肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(V)=(长径×宽径2)/2。6.为了研究照射后成纤维细胞促进ESCC细胞的迁移及侵袭与EMT有关,western blotting检测照射后成纤维细胞条件培养液和未照射成纤维细胞条件培养液培养24小时的ESCC细胞中上皮细胞标记物E-cadherin和间质细胞标记物波纹蛋白(vimentin)表达情况。并用免疫组化检测p-链蛋白(p-catenin)在照射组裸鼠移植瘤内的表达变化,未照射组为对照组。7.为探讨HDGF在放射线照射成纤维细胞促进ESCC细胞迁移与侵袭中的作用,采用western blotting检测照射后成纤维细胞条件培养液和未照射成纤维细胞条件培养液培养24小时的ESCC细胞中HDGF表达情况。并用免疫组化检测HDGF在照射组裸鼠移植瘤内的表达变化,未照射组为对照组。结果1.成纤维细胞的分离,提纯及特点结果表明从ESCC组织分离及培养的原代成纤维细胞保持成纤维细胞特性。用于本实验的所有成纤维细胞均为10代以内并表现为梭形细胞形态。3代以后的成纤维细胞E-cadherin未见表达,表明早期代数的成纤维细胞保持成纤维细胞特性。2.照射后成纤维细胞条件培养液增强ESCC细胞Scattering能力由于上皮细胞EMT的时候Scattering能力会有所增强,具体表现为细胞与细胞之间的黏附作用消失并获得较高活性的间质细胞表型,Scattering实验已被用于研究细胞的EMT和检测细胞迁移诱导能力。照射后成纤维细胞条件培养液增强ESCC细胞的Scattering能力并呈剂量依赖性。3.照射后成纤维细胞增强ESCC细胞的侵袭能力我们的研究表明ESCC细胞与未照射成纤维细胞共培养侵袭能力提高,当其与照射后成纤维细胞共培养其侵袭能力会得到进一步的增强。4.体内体外实验表明照射后成纤维细胞促进ESCC细胞EMT结果显示照射组中ESCC细胞E-cadherin呈剂量依赖性降低,vimentin随剂量依赖性升高并在所有组中高表达。体内体外实验表明P-catenin在照射组中都表达升高,免疫组化结果显示其在照射组肿瘤组织中的细胞核高表达及核转位。5.体内体外实验表明照射后成纤维细胞增强照射组中肿瘤细胞及成纤维细胞中HDGF的表达照射后成纤维细胞促进ESCC生长,特别是在Eca-9706肿瘤细胞组中。体内体外实验表明照射后成纤维细胞增强照射组中肿瘤细胞及成纤维细胞中HDGF的表达。值得注意的是,与间质成纤维细胞相邻的肿瘤细胞HDGF在细胞核中有相对更高的表达,显示成纤维细胞的旁分泌效应。结论1.照射后CAFs促进ESCC细胞侵袭及EMT,增强其Scattering能力。2.照射后成纤维细胞诱导ESCC细胞β-catenin核转位。3.照射后成纤维细胞促进ESCC肿瘤生长及提高HDGF蛋白表达。