自从抗菌药在临床上使用以来，就在人类和动物感染性疾病治疗中起到了重要的作用。但是，随着抗生素和化疗药物的发展以及在临床上的广泛应用和滥用，尤其是兽医临床和饲料中的滥用，造成世界范围内耐药菌株迅速增加，导致抗生素效力逐渐下降甚至对某些病原菌束手无策，给畜牧业发展和人类健康带来了严重的潜在威胁。为了寻找解决临床严重细菌耐药问题的方法，我们针对动物专用新型广谱抗生素氟本尼考，进行深入的耐药机制的研究。 本文将耐氟苯尼考的floR基因部分基因片段插入pGEX-4T-2原核表达载体中，构建以BL21(DE3)CodonPlus为宿主菌的原核表达体系。通过摸索IPTG的诱导浓度、诱导温度和菌株收获时间等条件，确定了floR1基因能在pGEX4T/BL21(DE3)codonplus中高效表达，且表达的重组蛋白为包涵体。采用超声波裂解配以曲通-尿素对包涵体进行洗涤的方法在pGEX表达系中取得了较好的效果。使用分步透析法对变性的包涵体进行复性，将复性蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST-FloR1融合蛋白。并以GST-FloR1融合蛋白为抗原，成功制备出抗GST-FloR1融合蛋白的抗体。 为了进一步阐明氟苯尼考的耐药机制，本文通过列floR基因上游调控序列的分析，成功构建了pGEM/floR及pBR322/floR质粒，随后转入到了基因工程菌JM109中，两株工程菌均显示对氯霉素和氟苯尼考耐药。 利用研究建立的测定氟苯尼考在细菌内积聚的HPLC法测定了氟苯尼考在敏感和耐药大肠杆菌内的积聚及抗体孵育后药物在敏感和耐药大肠杆菌内的积聚。结果显示耐氟苯尼考菌株比敏感菌株对氟苯尼考的积聚明显降低，达到稳态后，耐药大肠杆菌对氟苯尼考的积聚约低于敏感大肠杆菌的3.5倍；与抗体孵育的耐药菌，不管是实验室构建的基因工程菌还是临床分离菌，药物在菌体内的蓄积量明显增加，而对照敏感菌JM109，不管是否与抗体孵育，氟苯尼考在菌体内的蓄积量没有明显变化，这说明抗体能提高耐药细菌对药物的敏感性。结果在国内外首次初步证实了floR基因编码的FloR蛋白在细胞膜上由质子驱动力介导并通过主动外排泵贡献细菌对氟苯尼考的耐药性。 利用纯化的抗血清建立了ELISA方法并进行临床氟苯尼考耐药菌的监测。在以多克隆抗体建立的ELISA方法中，用方阵滴定法确定包被抗原GST-FloR1的最适包被浓度为300ng/ml，抗血清的最高效价为1∶204800，抗血清纯化后的最佳工作浓度为1∶6400，采用间接竞争ELISA法建立检测FloR1的标准曲线，线性检测范围为6.25ng/ml～200ng/ml。采用间接竞争ELISA方法对临床菌株的监测结果显示，氟苯尼考的MICs和FloR1蛋白含量及ELISAOD值呈现很强的线性关系。在已经检测的细菌中当ELISA的OD值≤0.641时，均为耐药性菌株。通过对数据的分析初步得出，OD=0.8879或对应的平均蛋白浓度加上3倍的标准偏差值(3.04ng/mL)可作为临界点来筛选临床细菌是否含有floR基因。