补体系统(complement system)是将对病原体的识别有效地转化为宿主对最初感染发挥防御功能的主要机制之一。补体活化的三个主要结果是对病原体的调理作用、招募炎症细胞及形成膜攻击复合物(MAC)直接杀死病原体。然而,该系统的非正常激活会引起人体免疫系统的过度反应,造成正常组织的损伤,参与多种疾病的病理过程,临床上目前尚无理想的治疗药物。近年来,本课题组致力于中药补体抑制剂的研究,分离得到一些高效、低毒的小分子或均一的大分子多糖类天然补体抑制剂。本文在以往对小叶黑柴胡(Bupleurum smithii Wolff var. parvifolium Shan et Y. Li)抗补体活性成分研究的基础上,进一步针对小叶黑柴胡总多糖的制备工艺优化及多糖内毒素清除等多糖的质量控制方面展开研究,优化了柴胡多糖的制备工艺；建立了总多糖中内毒素(LPS)的清除方法。北柴胡(Bupleurum chinense DC.)为中国药典收载品种,是传统清热毒中药,在我国已有2000多年的应用历史,也是商品柴胡的主流品种；通过体外活性筛选发现北柴胡总多糖具有较强体外抗补体活性；同时,北柴胡的总多糖部位对内毒素(LPS)诱发的小鼠急性肺损伤(ALI)具有良好的治疗作用,故本课题也以北柴胡总多糖作为研究对象,以期发现总多糖中有价值的补体抑制活性成分并对其在补体激活过程中的作用机制进行初步探讨。本文对北柴胡及小叶黑柴胡总多糖各种衍生物的抗补体活性及作用靶点进行了初步研究,以期找到活性增强的产物。并以柴胡属药材为例,对清热解毒中药体外抗补体活性测定法在药材质量评价中的应用进行了初步探讨。主要研究结果如下：1.柴胡抗补体活性部位的确定考察了10批次柴胡商品药材的醇提物和水提物的体外抗补体活性。结果表明：各批样品的醇提部位均无抗补体活性,水提部分则显示不同程度的抗补体活性。选取承德产北柴胡(水提液CP50:0.236±0.03mg/ml)作为研究对象,对其水提液进行醇沉,沉淀除去游离蛋白,透析除去小分子后得到总多糖部位(CP50:0.135±0.03mg/ml; AP50:0.418±0.02mg/ml)的抗补体活性最强,同时,我们在内毒素(LPS)诱导的急性肺损伤小鼠模型上给予北柴胡总多糖,进行北柴胡总多糖对急性肺损伤的药效研究,结果表明总多糖对小鼠急性肺损伤具有良好的治疗作用。因此确定总多糖为北柴胡抗补体活性部位。2.柴胡总多糖的制备工艺以小叶黑柴胡为研究对象,采用正交试验考察了总多糖的水提、醇沉工艺参数；比较了Sevage法、三氯醋酸法和木瓜蛋白酶法的对游离蛋白的清除效果。确定总多糖制备工艺流程如下：药材粉碎成粗粉,经95%乙醇渗漉脱脂后晾干,加16倍水,浸泡1.5小时,煎煮2次,每次2小时；提取液浓缩至相当于0.12g生药/ml,加乙醇至醇浓度为80%,静置24h,离心后弃上清液,沉淀以水复溶；复溶液在4℃下加入三氯醋酸至7%(体积分数),于4℃冰箱中放置2小时,取出后以10%NaOH中和至溶液PH值等于7,离心后取上清液对流水透析3天,减压浓缩至小体积,冻干即得总多糖。工艺验证实验表明,总多糖得率在5%左右,糖、糖醛酸及蛋白含量稳定,多糖得率较高。本工艺简便、快速、稳定、得率高,为柴胡总多糖制备流程的规范化和标准化提供借鉴。3.总多糖中内毒素的含量测定及清除本文使用显色基质鲎试剂,建立了针对多糖类化合物中内毒素的(LPS)含量测定方法。测定了本课题组自制的紫草、小叶黑柴胡、北柴胡和鱼腥草总多糖的LPS含量,分别为：29.58±3.27ng/mg、28.39±0.73ng/mg、66.77±1.90ng/mg、59.33±1.79ng/mg,结果说明各总多糖中LPS含量较低(ng级)。采用柱色谱联用技术对紫草和小叶黑柴胡总多糖中少量的LPS进行清除,疏水色谱与亲和吸附色谱联用得到了较好的清除效果：对紫草和小叶黑柴胡总多糖中LPS的清除率分别为44.51%、39.77%；紫草和小叶黑柴胡总多糖清除LPS后的经典途径抗补体活性值分别为：0.096±0.013mg/ml、0.288±0.037mg/ml,与原多糖相比,活性相当或略有提高。以上结果表明疏水色谱与亲和吸附色谱联用清除LPS的方法可行,并且不会减弱总多糖的抗补体活性。4.北柴胡总多糖部位的抗补体活性成分以经典途径的抗补体活性为导向,从北柴胡总多糖部位分离得到两个具有较强抗补体活性的多糖BC-PS1和BC-PS2,经高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)和高效毛细管电泳法(HPCE)确定两成分是均一的。采用NMR, GC、GC-MS、IR和甲基化等方法确定BC-PS1和BC-PS2的结构特征。BC-PS1为浅棕色疏松粉末,分子量>200万,蛋白含量：1.21%；糖醛酸含量：36.95%；糖含量97.56%；不含硫酸基。完全酸水解得到糖组成主要有Gal:GalA:Glc:Ara:Man:-1.6:1.1:1.8:1.7:1.0及少量Rha、Fuc、Xyl。甲基化分析结合完全酸水解结果显示其主要连接方式有：末端、1,4-和1,3-连接的Gal；末端、1,6-、1,4-、1,4,6-连接的Glc；末端、1,5-连接的Ara和末端、1,6-、1,4,6-连接的Man。其中以末端、1,5-连接的阿拉伯糖和末端、1,3-连接的半乳糖为主。BC-PS2为浅黄色疏松粉末。分子量160万,蛋白含量：1.11%；糖醛酸含量：0.75%；糖含量97.03%；不含硫酸基。完全酸水解得到糖组成主要有Glc:Ara:Gal:Man:=3.5:2.4:2.0:1.0及少量Rha、Xyl。甲基化分析结合完全酸水解结果显示其主要连接方式有：末端、1,6-、1,3-、1,3,6-连接的Glc；末端、1,5-连接的Ara；末端、1,6-、1,4-、1,4,6-连接的Gal和末端、1,4-、1,4,6-连接的Man。其中以末端、1,6-连接的葡萄糖和末端、1,4-连接的半乳糖为主。利用人血清作为补体来源评价两均一多糖的抗补体活性,结果显示BC-PS1和BC-PS2不仅对豚鼠血清中的补体成分有抑制作用,同样可以拮抗人血清中的补体成分。BC-PS1、BC-PS2对补体系统经典途径激活的半抑制浓度(CP50)分别为0.234±0.025mg/ml、0.264±0.013mg/ml; BC-PS1、BC-PS2对补体系统旁路途径激活的半抑制浓度(APso)分别为0.369±0.017mg/ml、0.362±0.032mg/ml;阳性对照药物肝素钠的CPso和APso值分别为0.226±0.014mg/ml、0.329±0.026mg/ml。自制了补体成分C1q、C2、C3、C4、C5、C9缺失的类补体缺失血清,进行了初步机制研究：考察了BC-PS1、BC-PS2和北柴胡总多糖的在补体激活过程中的作用靶点。研究发现BC-PS1作用于补体成分Clq、C2、C5和C9;BC-PS2作用于补体成分Clq、C2和C9；而北柴胡总多糖则作用于C1q～C9所有被测成分。以上结果提示BC-PS1、BC-PS2对补体系统作用的选择性比北柴胡总多糖增强了。肝素因具抗凝血作用而限制了其体内抗补体作用的发挥。本文采用凝血酶试剂考察了BC-PS1和BC-PS2对凝血系统的影响,结果显示二者无抗凝血作用。BC-PS1、BC-PS2抗补体活性与肝素相当,但不具抗凝血性质,预示着两个均一多糖将有良好的应用前景。5.北柴胡及小叶黑柴胡多糖衍生物的抗补体活性以北柴胡和小叶黑柴胡总多糖为底物,进行了硫酸化、羟乙基化和羧甲基化修饰,得到一系列多糖衍生化产物。硫酸化产物的IR光谱与原多糖相比,不仅位于3400cm-1左右的O-H键的伸缩振动峰变窄缩小,同时在818cm-1和1232cm-1出现了分别归属为C-S-O和S=O键的拉伸振动特征吸收；羟乙基化产物IR光谱与原多糖相比,位于3200-3600cm-1区域的O-H键的伸缩振动峰显著增强变宽,同时近2900cm-1处的C-H伸缩振动峰也大大增强,表明羟乙基已经取代在糖环的部分羟基上；羧甲基化衍生物IR图谱中显示了一个位于1736cm-1处羧基的特征吸收。最优衍生化条件下的硫酸化、羟乙基化和羧甲基化的北柴胡及小叶黑柴胡总多糖衍生物CPso值分别为0.107±0.03mg/ml、0.145±0.02mg/ml、0.099±0.02mg/ml和0.159±0.013mg/ml、0.327±0.022mg/ml、0.059±0.006mg/ml;最优衍生化条件下的硫酸化、羟乙基化和羧甲基化的北柴胡及小叶黑柴胡总多糖衍生物AP50值分别为0.102±0.04mg/ml、0.164±0.03mg/ml、0.188±0.04mg/ml和0.22±0.03mg/ml、0.144±0.02mg/ml、0.164±0.04mg/ml、结果表明衍生化产物比原多糖的体外抗补体活性均有显著提高。北柴胡和小叶黑柴胡多糖的各种衍生化产物的抗补体作用靶点也表现出多样性。6.体外抗补体活性测定法在柴胡质量评价中的应用进一步优化了溶血实验法,进行了方法学考察,建立起系统完善的中药材、活性部位及指标成分的体外抗补体活性测定技术,旨在对清热解毒中药体外抗补体活性测定法在药材质量评价中的应用进行初步探讨。收集了不同品种和产地的22批柴胡药材,按照优化的工艺流程制备了22批柴胡总多糖,对其进行了经典和旁路途径的抗补体活性测定,结果表明黑柴胡(Bupleurum smithii Wolff)总多糖的抗补体活性最强。对22批柴胡总多糖的活性测定结果取平均值后上浮20%作为活性限定值,暂定柴胡药材总多糖部位的经典途径抗补体活性CPs0值不得高于0.426mg/ml,旁路途径抗补体活性APs0值不得高于0.694mg/ml。