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反刍动物能够高效利用纤维物质为自身机体提供能量,主要依赖于瘤胃中大量的具有纤维分解能力的微生物。研究表明只有与饲料颗粒紧密结合的微生物才直接负责纤维物质的降解作用,于是,瘤胃微生物对纤维物质的粘附成为纤维降解的首要条件。微生物对纤维物质的粘附包括非特异性粘附和特异性粘附,有四种结构被认为与瘤胃微生物特异性粘附有关,多纤维素酶体、菌毛粘附素、多糖蛋白复合物层的碳水化合物抗原决定簇和酶的纤维素结合域(cellulose-bindingdomain,CBD)。
本研究利用酿酒酵母表面展示系统表达产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes)S85纤维素结合域(cellulose-binding domain,CBD)家族2(CBD2)、6(CBD6)11(CBD11),并分析这三个家族对复杂纤维物质的粘附位点。具体实验内容如下:将CBD2、CBD6和CBD11的基因插入到pYD1的AGA2的3’端,构建pMCBD2、pMCBD6和pMCBD11重组质粒,化学转化pMCBD2、pMCBD6和pMCBD11至EBY100中,在无氨基酸酵母氮源-酸水解酪素(YNB-CAA)诱导培养基中,2%半乳糖诱导CBD2、6和11表达于酿酒酵母表面。利用免疫组化技术(Anti-V5-FITC荧光抗体标记)监测重组酵母细胞在稻草茎细胞壁上的粘附位点。
结果显示CBD2对稻草厚壁组织、薄壁组织和维管组织细胞均有粘附,且荧光强度与细胞壁的厚度一致;CBD6粘附稻草片的厚壁组织和维管束,但是荧光强度较弱,CBD11可粘附稻草的厚壁组织和维管束,粘附量较少,荧光强度较弱。CBD2多序列比较和对三维结构分析显示本研究产琥珀酸丝状杆菌S85的CBD2是CBD2A型,能够粘附结晶性纤维素。现有资料显示,CBD6能与半纤维素(木葡聚糖、β-1,4-葡聚糖和β-1,3-葡聚糖)粘附,CBD11与非结晶性纤维素结合,而且CBD6和CBD11的粘附能力较CBD2弱,这与本研究结果一致。
综上所述,本试验研究表明利用酿酒酵母表面展示系统研究纤维素结合域在复杂的纤维物质上的粘附位点是可行的。来自产琥珀酸丝状杆菌S85的CBD2、CBD6和CBD11在稻草切片横断面上的粘附位点和粘附量都存在差异性。