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目的：
RpoE是由rpoE基因编码的sigma因子E，是一种胞质外因子，可在环境压力(例如高渗透压、热休克、氧化应激、酸应激)下引发沙门氏菌中一系列基因的转录。本文旨在探究在氨苄西林应激下，rpoE基因缺失对肠炎沙门菌肠炎亚种伤寒血清型(简称伤寒沙门菌)(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)非编码RNA(ncRNA)转录、生长、动力、毒力以及抗生素敏感性等多方面的影响，更加全面的了解RpoE的基本功能。
同时，由于耐多药的铜绿假单胞菌目前是引起医疗相关感染的主要原因，并且常常成为重症患者预后较差的因素，因而引起厂广泛关注。本实验旨在收集来自苏州大学附属第二医院产碳青霉烯酶的临床铜绿假单胞菌分离株，对其菌株基本信息、分子特征、临床药敏情况以及新型抑制剂—阿维巴坦(avibactam)联合药敏情况进行研究，初步探究头孢他啶-阿维巴坦、氨曲南-阿维巴坦对铜绿假单胞菌的体外敏感性。
方法：
一、氨苄西林应激下伤寒沙门菌非编码RNA的表达差异
1、RNA提取、测序及分析：氨苄西林应激不同时间时提取总RNA后寄送至生物医学技术公司进行测序和数据分析。
2、RNA逆转录及qRT-PCR鉴定：随机选取经测序分析有表达差异的部分ncRNA进行qRT-PCR检测，进一步验证这些ncRNA的差异表达情况。
3、Northern blot分析：选取qRT-PCR验证后的部分ncRNA进行Northern blot分析，进一步定量检测ncRNA的表达水平和大小。
二、RpoE对伤寒沙门菌生长及抗生素敏感性的影响
1、伤寒沙门菌生长曲线的测定：测定有／无氨苄西林应激下伤寒沙门菌野生株GIFU10007、rpoE缺陷株(△rpoE)和rpoE回补株GIFU10007(pBAD33rpoE)的生长曲线，判断rpoE基因对细菌生长和氨苄西林耐受的影响。
2、伤寒沙门菌运动性的测定:将伤寒沙门菌野生株GIFU10007、△rpoE和GIFU10007(pBAD33rpoE)在半固体动力培养琼脂穿刺培养48小时，观察其生长运动情况，判断rpoE基因对细菌运动方面的影响。
3、伤寒沙门菌大蜡螟幼虫感染模型的建立:用上述三种伤寒沙门菌菌株感染大蜡螟，连续观察三天，记录不同分组大蜡螟存活情况，判断rpoE基因对细菌毒力方面的影响。
4、抗生素药敏实验:在Mueller Hinton(MH)培养平板上涂布0.5麦氏浓度的上述三种伤寒沙门菌菌株，使用临床实验室协会标准(CLSI)的规范利用K-B法进行药敏实验和结果的判读，判断rpoE基因对细菌抗生素敏感性方面的影响。
5、外膜蛋白(OMF)表达遗检测:利用qRT-PCR检测上述三种伤寒沙门菌菌株外膜蛋门基因ompF和ompC的表达量，判断rpoE基因对细菌外膜蛋白表达方面的影响。
三、耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌流行病学研究
1、菌株鉴定:所有分离株均使用MALDI-TOF MS仪器(Bruker，Germany)进行菌种鉴定。同时进行16S rRNAPCR扩增，扩增产物测序后比对验证菌种。
2、耐药基因分子检测:用PCR法进行常见耐药基因的筛选，进行检测的基因包括:碳青霉烯酶编码基因blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP和blaOXA-48;超广谱β-内酰胺酶编码基因blaCTX-M、blaTEM和blaSHV;AmpC头孢菌素酶编码基因blaCMY。结果测序并且与GeneBank进行比对后确认。
3、临床抗生素药敏实验:采用Phoenix-100全自动微生物分析仪(BD)、革兰阴性菌药敏卡和药敏纸片对临床17株产碳青霉烯酶铜绿假单胞菌分离株进行抗尘素敏感性检测。
4、阿维巴坦(Avibactam)联合药敏实验:遵循2018年在临床实验室协会标准(CLSI)指南，使用标准液体培养基微量稀释方法对9株产A类碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌进行头孢他啶-阿维巴坦联合药敏实验，对8株产B类碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌进行氨曲南-阿维巴坦联合药敏实验。
5、全基因组测序和绘制进化树:将上述17株产碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌送生物公司进行全基因组测序，了解其携带耐药基因的具体情况;同时绘制9株产A类碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌菌株的进化树，了解产KPC的铜绿假单胞菌菌株克隆情况。
结果:
一、氨苄西林应激下伤寒沙门菌非编码RNA的表达差异
1、RNA提取、测序及分析:通过热图和测序结果，分析发现了57个具有显著转录变化的ncRNA，GO分析显示57个差异表达的ncRNA可能与多种生物过程、细胞组成和分子功能方面密切相关。
2、RNA逆转录及qRT-PCR鉴定:在氨苄西林应激条件下经qRT-PCR验证了其中4个表达差异ncRNA，结果与前期测序初步一致，推测其可能功能与细胞感知、应激和抗生素抗性有关。
3、Northern blot分析:Northern blot分析没有显示出经qRT-PCR验证上调的两个ncRNA-qscaffold39_minus_2和scaffold87_minus_2的转录情况及差异，可能是由于ncRNA的转录拷贝数较少，并且Northern blot与基于qRT-PCR的方法相比并不那么敏感所致。
二、RpoE对伤寒沙门菌生长及抗生素敏感性的影响
1、伤寒沙门菌生长曲线的测定:在无氨苄西林抗生素应激下，三种伤寒沙门菌菌株的生长情况较一致，未见明显差异;在氨苄西林抗生素应激下，△rpoE菌株的生长速率及生长水平均高于其余二者，提示rpoE基因影响细菌生长和对氨苄西林的耐受力。
2、伤寒沙门菌运动性的测定:培养后观察到伤寒沙门菌野生株GIFU10007穿刺线旁有浑浊迁徙生长，△rpoE和GIFU10007(pBAD33rpoE)均无明显现象，提示rpoE基因可能使伤寒沙门菌的运动性增强。
3、伤寒沙门菌大蜡螟幼虫感染模型的建立:细菌感染大蜡螟幼虫72h后，伤寒沙门菌野生株GIFU10007组和GIFU10007(pBAD33rpoE)组的存活率明显低于△rpoE组，提示rpoE基因可能使伤寒沙门菌的毒力增强。
4、抗生素药敏实验:在所检测的抗生素中，△rpoE中13种(13/19，68.4％)抗生素的抑菌圈直径和野生型相比有3mm及以上的变化，表示其抗生素敏感性降低，提示rpoE基因的缺欠可能对细菌青霉素类抗生素敏感性的影响较大。
5、外膜蛋白表达量检测(qRT-PCR):两种主要的外膜蛋白基因ompC和ompF在△rpoE菌株中的表达量均明显减少，提示rpoE基因的缺失影响伤寒沙门菌外膜蛋白的表达，进而可能影响菌株的药敏实验结果。
三、耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌分子流行病学研究
1、菌株鉴定与耐药基因分子检测:所有分离株均正确鉴定为耐碳青霉烯类抗生素的铜绿假单胞菌，用PCR法进行常见耐药基因的筛选，结果经测序比对后确认9株共携带blaKPC和blaTEM，5株携带blaIMP，三株携带blaNDM。
2、临床抗生素药敏实验:17株产碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌分离株呈现高度耐药，特别是对氨苄西林、美罗培南、亚胺培南、头孢唑林、头孢吡肟、庆大霉素、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸和复方新诺明均表现为耐药。
3、阿维巴坦(Avibactam)联合药敏实验:阿维巴坦(4μg/ml)的添加均不同程度地降低了头孢他啶和氨曲南的MIC，提示头孢他啶-阿维巴坦、氨曲南-阿维巴坦的联合用药在治疗该类感染时可能具有良好的活性。
4、全基因组测序和绘制进化树:全基因组测序发现分离株均携带与其他抗生素相关的耐药基因，进化树显示9株产KPC菌株(均分离于2015年之前)属于同一个分枝。
结论:
1、rpoE基因缺失影响伤寒沙门菌57个ncRNA的转录变化，ncRNA可能与RpoE调控伤寒沙门菌的生长、应激及抗生素敏感性方面相关。
2、rpoE基因的缺失影响伤寒沙门菌生长水平、运动性、毒力、抗生素敏感性及外膜蛋白表达。
3、头孢他啶-阿维巴坦、氨曲南-阿维巴坦的联合用药在治疗产A类和B类碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌感染时可能具有良好的活性；我院亦或是苏州地区2015年前可能存在铜绿假单胞菌同一克隆(KPC-2)的流行传播。
RpoE是由rpoE基因编码的sigma因子E，是一种胞质外因子，可在环境压力(例如高渗透压、热休克、氧化应激、酸应激)下引发沙门氏菌中一系列基因的转录。本文旨在探究在氨苄西林应激下，rpoE基因缺失对肠炎沙门菌肠炎亚种伤寒血清型(简称伤寒沙门菌)(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)非编码RNA(ncRNA)转录、生长、动力、毒力以及抗生素敏感性等多方面的影响，更加全面的了解RpoE的基本功能。
同时，由于耐多药的铜绿假单胞菌目前是引起医疗相关感染的主要原因，并且常常成为重症患者预后较差的因素，因而引起厂广泛关注。本实验旨在收集来自苏州大学附属第二医院产碳青霉烯酶的临床铜绿假单胞菌分离株，对其菌株基本信息、分子特征、临床药敏情况以及新型抑制剂—阿维巴坦(avibactam)联合药敏情况进行研究，初步探究头孢他啶-阿维巴坦、氨曲南-阿维巴坦对铜绿假单胞菌的体外敏感性。
方法：
一、氨苄西林应激下伤寒沙门菌非编码RNA的表达差异
1、RNA提取、测序及分析：氨苄西林应激不同时间时提取总RNA后寄送至生物医学技术公司进行测序和数据分析。
2、RNA逆转录及qRT-PCR鉴定：随机选取经测序分析有表达差异的部分ncRNA进行qRT-PCR检测，进一步验证这些ncRNA的差异表达情况。
3、Northern blot分析：选取qRT-PCR验证后的部分ncRNA进行Northern blot分析，进一步定量检测ncRNA的表达水平和大小。
二、RpoE对伤寒沙门菌生长及抗生素敏感性的影响
1、伤寒沙门菌生长曲线的测定：测定有／无氨苄西林应激下伤寒沙门菌野生株GIFU10007、rpoE缺陷株(△rpoE)和rpoE回补株GIFU10007(pBAD33rpoE)的生长曲线，判断rpoE基因对细菌生长和氨苄西林耐受的影响。
2、伤寒沙门菌运动性的测定:将伤寒沙门菌野生株GIFU10007、△rpoE和GIFU10007(pBAD33rpoE)在半固体动力培养琼脂穿刺培养48小时，观察其生长运动情况，判断rpoE基因对细菌运动方面的影响。
3、伤寒沙门菌大蜡螟幼虫感染模型的建立:用上述三种伤寒沙门菌菌株感染大蜡螟，连续观察三天，记录不同分组大蜡螟存活情况，判断rpoE基因对细菌毒力方面的影响。
4、抗生素药敏实验:在Mueller Hinton(MH)培养平板上涂布0.5麦氏浓度的上述三种伤寒沙门菌菌株，使用临床实验室协会标准(CLSI)的规范利用K-B法进行药敏实验和结果的判读，判断rpoE基因对细菌抗生素敏感性方面的影响。
5、外膜蛋白(OMF)表达遗检测:利用qRT-PCR检测上述三种伤寒沙门菌菌株外膜蛋门基因ompF和ompC的表达量，判断rpoE基因对细菌外膜蛋白表达方面的影响。
三、耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌流行病学研究
1、菌株鉴定:所有分离株均使用MALDI-TOF MS仪器(Bruker，Germany)进行菌种鉴定。同时进行16S rRNAPCR扩增，扩增产物测序后比对验证菌种。
2、耐药基因分子检测:用PCR法进行常见耐药基因的筛选，进行检测的基因包括:碳青霉烯酶编码基因blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP和blaOXA-48;超广谱β-内酰胺酶编码基因blaCTX-M、blaTEM和blaSHV;AmpC头孢菌素酶编码基因blaCMY。结果测序并且与GeneBank进行比对后确认。
3、临床抗生素药敏实验:采用Phoenix-100全自动微生物分析仪(BD)、革兰阴性菌药敏卡和药敏纸片对临床17株产碳青霉烯酶铜绿假单胞菌分离株进行抗尘素敏感性检测。
4、阿维巴坦(Avibactam)联合药敏实验:遵循2018年在临床实验室协会标准(CLSI)指南，使用标准液体培养基微量稀释方法对9株产A类碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌进行头孢他啶-阿维巴坦联合药敏实验，对8株产B类碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌进行氨曲南-阿维巴坦联合药敏实验。
5、全基因组测序和绘制进化树:将上述17株产碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌送生物公司进行全基因组测序，了解其携带耐药基因的具体情况;同时绘制9株产A类碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌菌株的进化树，了解产KPC的铜绿假单胞菌菌株克隆情况。
结果:
一、氨苄西林应激下伤寒沙门菌非编码RNA的表达差异
1、RNA提取、测序及分析:通过热图和测序结果，分析发现了57个具有显著转录变化的ncRNA，GO分析显示57个差异表达的ncRNA可能与多种生物过程、细胞组成和分子功能方面密切相关。
2、RNA逆转录及qRT-PCR鉴定:在氨苄西林应激条件下经qRT-PCR验证了其中4个表达差异ncRNA，结果与前期测序初步一致，推测其可能功能与细胞感知、应激和抗生素抗性有关。
3、Northern blot分析:Northern blot分析没有显示出经qRT-PCR验证上调的两个ncRNA-qscaffold39_minus_2和scaffold87_minus_2的转录情况及差异，可能是由于ncRNA的转录拷贝数较少，并且Northern blot与基于qRT-PCR的方法相比并不那么敏感所致。
二、RpoE对伤寒沙门菌生长及抗生素敏感性的影响
1、伤寒沙门菌生长曲线的测定:在无氨苄西林抗生素应激下，三种伤寒沙门菌菌株的生长情况较一致，未见明显差异;在氨苄西林抗生素应激下，△rpoE菌株的生长速率及生长水平均高于其余二者，提示rpoE基因影响细菌生长和对氨苄西林的耐受力。
2、伤寒沙门菌运动性的测定:培养后观察到伤寒沙门菌野生株GIFU10007穿刺线旁有浑浊迁徙生长，△rpoE和GIFU10007(pBAD33rpoE)均无明显现象，提示rpoE基因可能使伤寒沙门菌的运动性增强。
3、伤寒沙门菌大蜡螟幼虫感染模型的建立:细菌感染大蜡螟幼虫72h后，伤寒沙门菌野生株GIFU10007组和GIFU10007(pBAD33rpoE)组的存活率明显低于△rpoE组，提示rpoE基因可能使伤寒沙门菌的毒力增强。
4、抗生素药敏实验:在所检测的抗生素中，△rpoE中13种(13/19，68.4％)抗生素的抑菌圈直径和野生型相比有3mm及以上的变化，表示其抗生素敏感性降低，提示rpoE基因的缺欠可能对细菌青霉素类抗生素敏感性的影响较大。
5、外膜蛋白表达量检测(qRT-PCR):两种主要的外膜蛋白基因ompC和ompF在△rpoE菌株中的表达量均明显减少，提示rpoE基因的缺失影响伤寒沙门菌外膜蛋白的表达，进而可能影响菌株的药敏实验结果。
三、耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌分子流行病学研究
1、菌株鉴定与耐药基因分子检测:所有分离株均正确鉴定为耐碳青霉烯类抗生素的铜绿假单胞菌，用PCR法进行常见耐药基因的筛选，结果经测序比对后确认9株共携带blaKPC和blaTEM，5株携带blaIMP，三株携带blaNDM。
2、临床抗生素药敏实验:17株产碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌分离株呈现高度耐药，特别是对氨苄西林、美罗培南、亚胺培南、头孢唑林、头孢吡肟、庆大霉素、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸和复方新诺明均表现为耐药。
3、阿维巴坦(Avibactam)联合药敏实验:阿维巴坦(4μg/ml)的添加均不同程度地降低了头孢他啶和氨曲南的MIC，提示头孢他啶-阿维巴坦、氨曲南-阿维巴坦的联合用药在治疗该类感染时可能具有良好的活性。
4、全基因组测序和绘制进化树:全基因组测序发现分离株均携带与其他抗生素相关的耐药基因，进化树显示9株产KPC菌株(均分离于2015年之前)属于同一个分枝。
结论:
1、rpoE基因缺失影响伤寒沙门菌57个ncRNA的转录变化，ncRNA可能与RpoE调控伤寒沙门菌的生长、应激及抗生素敏感性方面相关。
2、rpoE基因的缺失影响伤寒沙门菌生长水平、运动性、毒力、抗生素敏感性及外膜蛋白表达。
3、头孢他啶-阿维巴坦、氨曲南-阿维巴坦的联合用药在治疗产A类和B类碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌感染时可能具有良好的活性；我院亦或是苏州地区2015年前可能存在铜绿假单胞菌同一克隆(KPC-2)的流行传播。