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结核病(Tuberculosis, TB)是一种由结核分枝杆菌(Mycobactium tuberculosis，简称结核杆菌)感染引起的人畜共患慢性传染病，仍然是当今威胁人类健康的最主要疾病之一。结核病的传统诊断方法易受多种因素的干扰而产生较高的假阳性或假阴性结果，不利于结核病的早期确诊与治疗，因此，发展新颖有效、灵敏度高和特异性强的诊断技术非常必要。尽管不少结核杆菌抗原已经被鉴定，但是其中大多数不适合应用于鉴别诊断卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）免疫接种的健康人群与真正的结核病患者。结核杆菌基因组约10%序列用于编码PE（theproteins which contain Pro-Glu (PE) motif）和PPE（the proteins which containPro-Pro-Glu (PPE) motif）蛋白家族，且该家族蛋白为结核杆菌所特有。目前已有一些关于PPE蛋白家族成员已被成功鉴定并加以应用，但较为系统地分析PPE蛋白免疫原性的报道尚不多见。本研究应用系统进化分析法选取10个PPE蛋白家族成员作为研究对象，PCR扩增PPE蛋白编码基因后克隆至pET32a或pET41a质粒中构建重组PPE蛋白表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）并筛选阳性表达菌株。重组表达的PPE融合蛋白用金属螯合镍离子柱亲和层析分离纯化，纯化的重组PPE融合蛋白作为目标抗原分别包被96孔酶标板，建立标准的ELISA为基础的血清学检查方法，用于结核病的早期诊断。60例临床确诊的结核病人和30例健康人的血清被用作ELISA检测，所得OD值经SPSS17.0软件分析制作ROC曲线，通过ROC曲线来计算ELISA灵敏度和特异性，并进一步评估各个PPE抗原用作早期血清学诊断的价值。本研究在大肠杆菌中克隆、表达了10个选择的PPE抗原，然而PPE68未能纯化成功。以纯化的PPE蛋白作为包被抗原建立了ELISA血清学诊断方法，结果发现所有以PPE蛋白作为抗原的ELISA检测灵敏度均比Ag85A（antigen85A）高。Ag85A抗原的ROC曲线下面积仅0.573，而所有PPE蛋白ROC曲线下面积均大于0.679，说明PPE蛋白作为抗原的血清学诊断的准确性更高。这是因为Ag85A不仅存在于结核杆菌中，也存在于BCG等其他分枝杆菌中，易引起交叉反应，因而特异性不高。在选择的五类PPE抗原中，第一类PPE蛋白（PPE68）未能成功纯化；第二类PPE蛋白（PPE37）检测的特异性最高（99.3%），仅次于结核杆菌特异性抗原ESAT-6（early secretory antigenic target-6），但其检测灵敏度（65%）和准确性（ROC曲线下面积0.738）均比ESAT-6高，且国内外未见有报道，提示其可作为一种新型的候选抗原应用于结核病的早期血清学诊断研究；第三类PPE蛋白（PPE36、PPE41、PPE57、 PPE58、PPE59、PPE69）的检测灵敏度（65%~80%）和准确度（ROC曲线下面积0.761~0.805）均要高于PPE37，然而其特异性略低（80%~93.3%），与相关文献报道的结果一致；第四类PPE蛋白（PPE17）的检测灵敏度（63.3%）、特异性（83.3%）和准确性（ROC曲线下面积0.679）均不高；第五类PPE蛋白（PPE64）的检测灵敏度（63.3%）、特异性（90%）和准确性（ROC曲线下面积0.757）与PPE37相近，提示其也可以作为新型血清学诊断的候选抗原之一。本研究成功克隆、表达并纯化了9个PPE抗原，应用ELISA方法初步验证了PPE抗原的良好免疫原性，第二类PPE抗原PPE37和第五类PPE抗原PPE64的检测灵敏度、特异性和准确性都要明显优于ESAT-6，且目前国内外尚未有相关研究报道，提示这两种PPE蛋白可作为血清学诊断的候选抗原。我们还将进一步应用这些纯化的PPE抗原刺激结核病人的外周血单核细胞并分析其引起的细胞免疫反应，综合评价PPE抗原的免疫原性并探讨其在结核病诊断或疫苗研究中的意义。