MC1R和ASIP基因在马毛色中的协同作用研究及马微卫星13重PCR体系的构建

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:socheapke
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近年来我国马产业发展迅速,许多具有优质血统的纯种马匹被进口至国内用于参加各项赛事和繁育优秀的后代,纯正的血统和不同的毛色直接影响着马匹的价值。以往研究表明,melanocortin-1receptor(MC1R)和agoutisignalingprotein(ASIP)是调控哺乳动物毛色的两个最为重要的基因。在对马毛色的研究中,已发现MC1R基因C901T位置的突变可导致栗色毛色的产生,而ASIP基因第二外显子中11bp的缺失能导致黑色毛色的产生。然而,这两个基因在深浅不同的马毛色中发挥了怎样的精细和协调调控作用尚不清楚。本研究共采集15个品种的709匹毛色由深到浅(黑色、褐骝色、深骝色、骝色、栗色、青色、白色)的马匹毛发样本,检测了所有马匹在MC1R和ASIP基因上特定功能位点的基因分型,通过统计和分析各种基因型组合和分布规律,发现了这两个基因在马毛色深浅变化中可能的重要协同作用关系。为证明新生马驹的血统,各国马业协会通过微卫星亲子鉴定技术为马驹做血统鉴定,并进行登记、颁发护照和建立繁育记录。国际动物遗传学会推荐了17个用于马匹个体识别和亲子鉴定的微卫星位点,分为12个核心位点(AHT4,AHT5,ASB2,ASB17,ASB23,HMS2,HMS3,HMS6,HMS7,HTG4,HTG10和VHL20)和5个非核心位点(CA425,HMS1,HTG6,HTG7和LEX3)。以往报道的检测方法存在较多的问题,例如未包含全部核心位点、PCR时间长、成本高、效率低,特别是引物特异性低导致部分位点检测结果不准确。为解决这些问题,本研究构建了两组微卫星多重PCR体系,并通过一系列后续试验检验了两个体系的灵敏度、物种特异性、可重复性、可靠性,对各项关键参数进行了计算、分析和说明。本论文主要研究结果是:(1)研究发现MC1R和ASIP基因的不同分型与马匹的毛色深浅具有显著的关联性。MC1R基因的E~EE~E分型在群体中所占的比例随着马匹毛色由深至浅而逐渐降低:黑色(64.5%),褐骝色(67.5%),深骝色(47.0%),骝色(16.5%),栗色(0.0%);而ASIP基因的A~AA~A分型在群体中所占的比例则随着马匹毛色由深至浅而逐渐升高:黑色(0.0%),褐骝色(22.9%),深骝色(69.2%),骝色(83.0%)。联合分析两个基因的分型时(MC1R-ASIP),由深色的黑色毛色到浅色的栗色的马中的优势基因型也随之发生改变:黑色(E~EE~E-A~aA~a,64.5%),褐骝色(E~EE~E-A~AA~a,47%),深骝色(E~EE~E-A~AA~A,36.2%和E~EE~e-A~AA~A,33%),骝色(E~EE~e-A~AA~A,69.6%),栗色(E~eE~e-A~AA~A,62.6%)。以上结果表明MC1R和ASIP基因通过不同的分型组合,共同的影响了马匹毛色的深浅变化。(2)通过微卫星引物重设计和多重PCR体系构建与优化试验,构建了一组用于马的微卫星13重PCR体系,解决了以往文献中报道的部分位点引物特异性差和扩增效率低的问题,仅通过一次PCR反应即可检测12个核心位点的基因分型结果,同时也具备性别检测能力。优化后的13重PCR体系体积为10ul,PCR反应程序时间为55分钟,最低模板加入量为1ng。本体系具有良好的灵敏度、物种特异性、可重复性和可靠性。二联体和三联体累积非父排除率(CPE_(duo)和CPE_(trio))分别为0.994659935和0.999854032。这一检测体系可用于马匹的个体识别和亲子鉴定,也适用于基于微卫星标记的马匹群体遗传多样性研究。(3)通过试验构建了一组马微卫星五重PCR体系,用于检测5个非核心位点的分型结果。这一体系具有良好的灵敏度、物种特异性、可重复性和可靠性。优化后的五重PCR体系反应体积为:10ul;PCR程序时间为55分钟;最低DNA加入量为0.5ng。二联体累积非父排除率(CPE_(duo))和三联体累积非父排除率(CPE_(trio))的数值分别为0.778582831和0.935585818。综上所述,本研究进一步揭示了马毛色调控的分子机制,为下游研究提供了理论基础;通过重新设计多重微卫星PCR体系,对现有亲子鉴定技术进行了革新,以期对马产业的发展起到技术支持和推动的作用。
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