尿皮素Ⅱ对大鼠下丘脑室旁核小细胞分泌神经元活动的影响

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目的:利用急性脑片全细胞膜片钳记录、神经药理学和组织化学染色技术,研究尿皮素Ⅱ(UCNⅡ)对幼年大鼠PVN分泌型小细胞自发性放电和膜电位的影响机制。  方法:本研究使用生后为15-26天(Postnatal day15-26,P15-P26)的Wistar系大鼠,用异氟烷吸入麻醉后,迅速断头取脑,然后用振动切片机来制备含PVN的下丘脑切片,切片厚度为250微米。在室温下(24-25℃),将含有下丘脑室旁核的脑切片放置于人工脑脊液(ACSF)中孵育60分钟以上,对ACSF持续充有95%O2和5% CO2混合气体。ACSF的组成成分如下:118 mM NaCl,3 mM KCl,1 mM MgCl2.6H2O,1mM NaH2PO4.2H2O,25 mM NaHCO3,10 mM D-Glucose,2mM CaCl2。PH值为7.25-7.35,渗透压为295-300 mOsM。记录电极内灌装7微升电极内液,内液组成成分如下:120mM potassium gluconate,10mMHEPES,1 mMEGTA,5mMKCl,3.5 mM MgCl2,4mM NaCl,8 mM biocytin,4 mM Na2ATP,0.2 mM Na2GTP。用KOH将pH值调为7.3。电极阻抗为5-7MΩ。PVN神经元电活动使用全细胞膜片钳系统记录,收集的数据存于电脑硬盘中,并将完整记录而且基线相对稳定的电生理数据用于最后的数据处理与统计学分析。电生理记录完成后,将下丘脑片固定于4%多聚甲醛中24小时以上,然后行DAB染色。在显微镜下,观察神经元的位置和形态学特点并拍照获取染色结果。电生理的实验数据采用Clampfit10.4软件进行分析,数据的统计学分析采用的是SPSS软件,用配对T检验来比较给药前后的平均数,P<0.05,记录结果认为有统计学差异。  结果:  1.在电流钳下(current-clamp recording mode),PVN小细胞分泌神经元对去极化电流刺激敏感,但没有明显内向整流电流、低阈值放电(LTS)和超极化活化内向电流(Ih)。  2.在电流钳下,UCNⅡ(100 nM)可导致34.7%的PVN小细胞分泌神经元的放电频率明显降低,冲洗20分钟后恢复,UCNⅡ对自发性放电频率的影响随UCNⅡ浓度升高而减弱。  3.UCNⅡ抑制自发性放电的同时,导致膜电位的超极化,UCNⅡ导致的膜电位超极化对河豚毒素(TTX)不敏感。  4.在TTX存在条件下,UCNⅡ导致的PVN小细胞分泌神经元膜超极化具有剂量依存性,半数有效抑制浓度为37 nM。  5.UCNⅡ明显抑制由去极化电流刺激诱发的动作电位的数量,并明显降低细胞膜的输入阻抗。  6.电流-电压关系曲线分析表明,UCNⅡ敏感电流的翻转电位与钾离子平衡电位相近。  结论:本项研究表明UCNⅡ通过活化钾离子通道导致PVN小细胞分泌神经元亚群超极化和自发性放电频率降低,提示UCNⅡ与特异性受体结合直接影响PVN小细胞分泌神经元亚群的活动,参与调节该亚群的分泌功能。
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