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血管纹内体液-血液屏障(the intrastrial fluid-blood barrier)是血迷路屏障(blood-lybrinth barrier, BLB)的主要构成,它将内淋巴和血液分隔开。血迷路屏障从广义上讲,应该包括血-内淋巴、血-外淋巴、内-外淋巴之间的屏障。在本文中重点研究的是血管纹内淋巴-血液间的屏障,简称血迷路屏障。该屏障对于维持内耳内环境稳态,尤其是耳蜗内电位的形成非常重要,这些也正是形成正常听力的基础。很多听力相关性疾病,如自身免疫性内耳病,噪音相关性耳聋,老年性聋等都与该屏障功能障碍有关。然而对血迷路屏障的调节和机制研究很少。过去研究认为,血迷路屏障由基质膜和内皮细胞构成。内皮细胞被紧密连接结合在一起,从而形成了阻碍大部分血源性物质进入内耳的一道屏障。我们近期的研究发现,该屏障还有大量的周细胞和血管周常驻巨噬细胞样黑色素细胞(perivascular resident macrophage, PVM/Ms)。PVM/Ms借助胞浆足突与血管紧密连接,也正是与血管的这种特殊结构,预示了这类细胞的特殊功能。构成血-迷路屏障的各类细胞功能和形态复杂,PVM/Ms尤其如此,所以非常值得探讨。我们的早期试验中证实,PVM/Ms具有巨噬细胞的表面抗原,如F4/80,CD68, CDllb,所以将其界定为组织常驻巨噬细胞。在本研究中,我们发现此类细胞还具有黑色素细胞表面抗原和中间细胞的表面抗原。上述事实证明,PVM/Ms不同于传统意义上的组织常驻巨噬细胞,在内耳中,它还兼具多种细胞特性。因为这种细胞在形态上与神经胶质细胞类似,我们推测,他们是否具有像血脑屏障和血视网膜屏障中的神经胶质细胞的类似作用呢?众所周知,星形胶质细胞和神经胶质细胞在调节屏障系统通透性上有着重要作用。如果没有这些细胞,紧密连接相关蛋白缺失,致使内皮细胞间通透性增加,引起组织水肿。在本实验中,我们将通过探讨血管纹中内皮细胞(endothial cells, ECs)和PVM/Ms之间的关系及调控微血管通透性的机制来说明PVM/Ms对于血迷路屏障的重要性。这里分别通过体内试验和体外模型来研究。首先,通过扫描电镜分析和免疫荧光染色后3D重建,分析PVM/Ms在血管纹中的分布特点；利用RT-PCR等方法检测其可能具有的特性；接着自小鼠耳蜗血管纹内毛细血管网,原代培养并建立ECs和PVM/Ms细胞系进行试验；后续使用携带DT受体的转基因小鼠,消除PVM/Ms后进一步证实实验结果；最后我们利用转染技术等调控基因的表达,证明了色素上皮衍生因子(Pigment Epithelium Derived Factor, PEDF)可能是PVM/Ms调控血迷路屏障的信号分子机制。结果表明,PVM/Ms具有黑色素颗粒,通过胞体足突与血管纹内的血管网紧密连接,其表面表达F4-80、GST、GSTA4、 Kir4.1等特征性抗原；并且PVM/Ms通过调控PEDF的表达,调节紧密连接相关蛋白的表达,进而使血迷路屏障通透性改变。这证明了PVM/Ms作为一种多元化细胞,同时具备巨噬细胞、黑色素细胞及中间细胞的特性,它通过PEDF介导等信号分子机制,影响血管纹中血迷路屏障的通透性,因而对维持听力非常重要。第一部分：小鼠内耳外周常驻巨噬细胞样黑色素细胞的特点和在血迷路屏障中的分布目的：分析PVM/Ms在血管纹中的分布特点及可能具有的细胞特性,为下一步的功能研究提供基础依据。方法：1.扫描电镜观察血管纹的超微结构。2.免疫荧光化学染色法检测PVM/Ms具有的表面抗原。3.分别原代培养PVM/Ms和自小鼠血管纹中提取PVM/Ms。4. RT-PCR方法检测PVM/Ms具有的基因特性。结果：1.电镜及免疫荧光化学染色结果显示,PVM/Ms中具有黑色素颗粒,通过胞体足突与血管纹内的血管网紧密连接,其表面表达F4-80、GST、GSTA4、Kir4.1等特征性抗原。2.免疫荧光化学染色及RT-PCR结果表明PVM/Ms中可见F4-80、GST、GSTA4、 Kir4.1 mRNA的表达。结论：1.本文通过免疫荧光染色法和RT-PCR等方法分析检测了PVM/Ms的特征,结果显示PVM/Ms是兼具血管纹内中间细胞、组织常驻巨噬细胞和黑色素细胞特性的多功能细胞。2.通过给予PVM/Ms免疫化学染色后,对血管纹进行电镜扫描及3D结构重建,进一步分析PVM/Ms在血管纹中的分布特点。结果证明PVM/Ms存在于血管纹中,在结构上伸出足板与毛细血管壁紧紧相连,可能对调节血迷路屏障发挥重要作用。第二部分：内耳外周常驻巨噬细胞样黑色素细胞调节血迷路屏障通透性的机制研究目的：通过体内实验和体外实验的研究,探讨内耳外周常驻巨噬细胞样黑色素细胞调节血迷路屏障的机制。方法：1.建立ECs和PVM/Ms原代细胞系,利用共培养系统模拟建立血迷路屏障。2.半透膜方法检测模拟血迷路屏障在PVM/Ms存在前后的渗透性。3.利用转基因小鼠,建立PVM/Ms消除的动物模型,并进行听功能测试。4.用不同方法检测PVM/Ms消除的小鼠血管纹内毛细血管的通透性。5.利用模拟血迷路屏障,从基因及蛋白的角度分析PVM/Ms对内皮细胞连接相关蛋白质ZO-1、Occludin、Ve-cadherin等的调控。6.通过体内实验证实上述观点。结果：1.体外实验结果示PVM/Ms缺失后内皮单细胞层通透性增加。2.体内实验结果示消除PVM/Ms可以引起小鼠血管显著渗出和听力障碍。3. PVM/Ms通过调节紧密连接相关蛋白质的表达调控屏障系统的通透性。结论：1.本文自小鼠血管纹组织建立起ECs和PVM/Ms原代细胞系,可用于后续研究,且利用共培养系统模拟血迷路屏障,为进一步的功能研究提供了基础。2.本研究分别通过体外实验和在体实验,借助不同的分子生物学手段反复论证了PVM/Ms对于调节血迷路屏障及维持正常听力的重要性。第三部分：血管旁常驻巨噬细胞样黑色素细胞通过调控PEDF表达调节血迷路屏障的通透性目的：通过给予PEDFsiRNA,分别从体内和体外实验证实血管旁常驻巨噬细胞样黑色素细胞通过调控PEDF表达调节血迷路屏障的通透性。方法：1.通过免疫荧光化学染色法和ELISA法确定PVM/Ms和ECs可分别表达PEDF及PEDFRo2.分别转染原代PVM/Ms和活体小鼠,并确定转染效率。3.利用模拟血迷路屏障系统,从基因及蛋白的角度分析,在转染前后PVM/Ms对内皮细胞连接相关蛋白质ZO-1、Occludin、Ve-cadherin等的调控。4.通过在体实验证实上述观点。结果：1.免疫荧光化学染色法和ELISA法确定PVM/Ms和ECs可分别表达PEDF及PEDFR。2.免疫荧光及实时定量PCR结果证明体内及体外细胞转染成功,可用于后续实验。3.体内实验证实PEDF基因表达抑制引起细胞间紧密连接相关蛋白质基因及蛋白水平表达下降。4.体外实验证实PEDF基因表达抑制引起细胞间紧密连接相关蛋白质基因及蛋白水平表达下降。结论：1.血迷路屏障通透性改变是由于内皮细胞间紧密连接相关蛋白质ZO-1, occludin和ve-cadherin等的表达降低引起的,体内实验和体外实验均可以证实PEDF可以调控以上三种蛋白的表达。2.我们的实验还看到PVM/Ms和ECs分别表达PEDF和PEDFR,说明PVM/Ms调控内皮细胞间紧密连接相关蛋白质表达的机制之一可能是PEDF和PEDFR介导的信号途径。