研究背景异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transpalatation,allo-HSCT）是治愈恶性血液病的重要且有效的方法。急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host disease,aGVHD）是影响移植成败的重要并发症。临床上约40-60%的移植患者可并发aGVHD,激素抵抗的aGVHD造成的移植相关死亡率高达20%,严重影响患者长期生存。现行aGVHD一线治疗药物激素仅有半数缓解,一些新二线药物的具体疗效和机制仍不甚明确,发生治疗失败和激素抵抗的患者预后不容乐观。因此,寻找新的防治策略和靶点具有重要意义。近年来,作为一种新兴手段,aGVHD的细胞疗法在动物模型和临床研究上已有卓有成效的探索和实践。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs）因独特的低免疫原性和免疫负调节活性,具有防治aGVHD的潜在能力,该作用也被越来越多的报道证实。HUCMSCs缓解aGVHD的作用机制涉及抑制异基因T细胞活化、增殖等,而其是否与改善和恢复宿主体内肠道菌群多样性、影响肠道菌群代谢物调控宿主代谢有关目前无明确定论。在aGVHD的发生发展中,肠道菌群多样性的丢失影响和调控aGVHD的病理机制,肠道微生态的紊乱显示出与aGVHD显著的相关性。另一方面,肠道菌群分泌的庞大的代谢物被宿主吸收进一步影响aGVHD的发病,宿主整体的代谢状态也影响着aGVHD的演变,许多研究显示短链脂肪酸、吲哚等一系列代谢物的改变可影响甚至预测aGVHD,而对优势代谢物的补充则能缓解aGVHD。植物鞘氨醇（phytosphingosine,PHS）是一种鞘磷脂类物质,既往研究证实其具有抗炎、调节糖脂代谢等作用,而其是否具有缓解aGVHD的作用则鲜有报道,为此我们开展了此项研究。目的探讨HUCMSCs治疗aGVHD背景下对肠道菌群和代谢物的具体影响,为补充HUCMSCs发挥免疫调控作用机制、临床HUCMSCs及小分子代谢物植物鞘氨醇防治aGVHD的开展提供新的研究策略和靶点。方法1、使用8-12周龄雄性BALB/c小鼠作为受者、雄性C57 BL/6J小鼠作为供者,于移植当天给予受者7.5Gy的60Co源γ射线全身辐照清髓,6-8小时后,经尾静脉输注供者来源的骨髓细胞（5×10~6/只）作为对照组BM组,输注骨髓细胞（5×10~6/只）及脾脏细胞（5×10~6/只）作为aGVHD组。于移植后不同时间点观察记录各组小鼠移植后生存、体重缺失、临床评分变化,绘制曲线。2、移植后14天流式细胞术检测移植小鼠嵌合度及BM组、aGVHD组小鼠CD4+T细胞在靶器官（肝、肺、脾、小肠）中绝对数计数;ELISA检测血清IFN-γ、TNF-α浓度改变;HE染色观察aGVHD靶器官（肝、肺、结肠、小肠）病理学改变、淋巴细胞浸润情况。3、体外培养HUCMSCs,诱导成骨、成软骨、成脂分化21天后行相应特异性染色观察;流式细胞术检测表面特异性抗原表达情况（国际细胞治疗学会ISCT标准）。4、HUCMSCs联合移植（5×10~5/只）,分为aGVHD组和aGVHD+MSCs组,移植后不同时间点观察记录各组小鼠生存、体重、临床表现。5、移植后14天如上收集aGVHD组和aGVHD+MSCs组小鼠靶器官行切片后相应染色检测。ELISA检测血清IFN-γ、TNF-α、ST-2浓度改变;流式细胞术检测CD4+T细胞在靶器官中绝对数计数和凋亡水平、细胞因子表达变化。6、移植后14天收集aGVHD组和aGVHD+MSCs组小鼠的肠道内容物,送检宏基因测序检测HUCMSCs对aGVHD小鼠肠道菌群的影响。7、移植后14天收集aGVHD组和aGVHD+MSCs组小鼠的外周血血清,送检LC-MS/MS代谢组学分析检测HUCMSCs对aGVHD小鼠代谢的影响。8、aGVHD小鼠腹腔注射典型差异代谢物植物鞘氨醇溶液作为aGVHD+PHS组,注射DMSO溶液为对照组,移植后不同时间点观察记录各组小鼠生存、体重、临床表现;移植后14天重复上述实验观察各组小鼠病理损伤、血清炎症因子浓度的改变。9、体外培养并激活CD4+T细胞,使用典型差异代谢物植物鞘氨醇0μM、2.5μM、5μM、7.5μM、10μM处理细胞不同时间（24h,48h,72h）后CCK-8法测细胞活力。10、体外诱导CD4+T细胞向Th1分化,用植物鞘氨醇2.5μM作用于细胞5天后流式细胞术检测其凋亡、Th1细胞因子表达变化。11、送检转录组测序检测植物鞘氨醇对Th1分化的基因、通路的影响。12、RT-PCR检测植物鞘氨醇对Th1分化差异基因表达的影响。结果1、成功构建aGVHD小鼠模型。aGVHD组小鼠移植后第5-7天起出现弓背、耸毛、腹泻、体重减轻不能恢复、活力缺失等aGVHD发病表现,并于移植后第7-10天起陆续死亡,第30天后几乎无存活,生存率较BM组明显降低;BM组无上述表现,并能长期存活。2、流式细胞术结果示移植小鼠高表达H2-Kb,而对照组小鼠不表达,移植小鼠达完全嵌合,建模成功。3、HE染色结果示aGVHD组小鼠较BM组有显著的靶器官病理损伤和淋巴细胞浸润;ELISA结果示aGVHD组IFN-γ、TNF-α血清浓度升高;流式细胞术结果示在aGVHD靶器官中CD4+T细胞绝对数计数升高。4、分离、培养的HUCMSCs满足培养贴壁性;茜素红染色、阿利新蓝染色、油红O染色结果示HUCMSCs成骨、成软骨、成脂情况良好;流式细胞术结果示HUCMSCs高表达CD105、CD90、CD73。5、HUCMSCs联合移植后显著延长小鼠生存,降低临床评分;HE染色结果示aGVHD+MSCs组较aGVHD组靶器官病理损伤和淋巴细胞浸润情况缓解;ELISA结果示aGVHD+MSCs组IFN-γ、TNF-α、ST-2血清浓度降低;流式细胞术结果示aGVHD+MSCs组小鼠靶器官中CD4+T细胞凋亡升高且绝对数计数降低,Th1细胞表达的IFN-γ、TNF-α、IL-17水平降低。6、宏基因测序分析结果示aGVHD组和aGVHD+MSCs组肠道菌群组成显著不同,aGVHD组中差异菌群以Enterococcus faecalis为主,aGVHD+MSCs组中差异菌群以Bacteroides＿intestinalis为主,其相较于aGVHD组丰度增加,而Enterococcus faecalis丰度降低。7、代谢组学分析结果示aGVHD组和aGVHD+MSCs组代谢显著不同,aGVHD+MSCs组植物鞘氨醇（PHS）的表达上调。8、腹腔注射植物鞘氨醇显著延长aGVHD小鼠生存,降低临床评分;HE染色结果示aGVHD+PHS组较aGVHD组靶器官病理损伤和淋巴细胞浸润情况缓解;ELISA结果示aGVHD+PHS组IFN-γ、TNF-α、ST-2血清浓度降低。9、CCK-8结果示植物鞘氨醇对CD4+T细胞增殖呈浓度、时间依赖性抑制。10、流式细胞术结果示植物鞘氨醇2.5μM处理增加CD4+T细胞凋亡,降低Th1细胞IFN-γ、TNF-α的表达。11、转录组测序结果示植物鞘氨醇2.5μM处理显著改变CD4+T向Th1分化的基因、通路的表达。12、RT-PCR结果示植物鞘氨醇2.5μM处理上调PPARγ、IκB、Tnfaip3,下调stat4、T-bet等基因的表达。结论1、成功构建aGVHD小鼠模型,HUCMSCs输注可以显著减轻小鼠aGVHD;2、HUCMSCs输注可以影响aGVHD小鼠肠道菌群组成及代谢物改变;3、差异代谢物植物鞘氨醇可通过结合PPARγ抑制NF-κB信号通路影响STAT4/T-bet从而抑制CD4+T细胞向Th1分化,显著减轻小鼠aGVHD。