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在水产养殖体系中,氨氮浓度会随时间的延长而快速增加,现已成为蟹类健康养殖中一个主要的生理挑战。本文通过运用DGE技术构建和分析了三疣梭子蟹在氨氮胁迫下的鳃基因表达谱,检测了氨氮代谢终产物排出相关的通道蛋白基因表达水平、尿素和尿酸合成相关的酶基因表达水平,测定了各组织中氨氮代谢终产物含量的变化,深入探讨了三疣梭子蟹在氨氮胁迫下的生理适应机制、解毒代谢机制和代谢产物的排出机制。本论文主要内容包括以下三个方面：1应用DGE技术构建与分析三疣梭子蟹在氨氮胁迫下鳃基因表达谱本实验运用数字基因表达谱(DGE)技术构建了三疣梭子蟹在5mg/L NH4Cl胁迫48h下的鳃基因表达谱。共产生58,336条unigenes,平均长度为689bp。差异基因功能分类表明在氨氮胁迫下被显著调节的生理过程主要有氨基酸代谢、核苷酸代谢、线粒体膜电位调节、活性氧代谢、抗氧化及免疫响应。本文选择了分别对与抗氧化系统、线粒体电子传递、蛋白质消化与吸收、免疫系统相关的7个基因进行了实时定量PCR验证。本研究结果为更好的理解三疣梭子蟹在氨氮胁迫下分子响应机制提供了极具价值的基因信息。2三疣梭子蟹在氨氮胁迫下氨排出途径的研究本实验将三疣梭子蟹曝露于不同浓度(Omg/L、1mg/L、5mg/L)的NH4Cl溶液中,研究了氨氮胁迫对三疣梭子蟹血淋巴氨含量的影响;鳃组织中Na+/K+-ATP酶(α亚单位)(NKA)、H+-ATP酶(亚单位A)活力;鳃组织中Rh转氨蛋白(Rh)、K+通道(K+Channel)、Na+/K+/2C1共转运体(NKCC)、Na+/H+交换体(NHE)和与囊泡相关的膜蛋白(VAMP)基因表达水平的影响,同时观察了鳃组织的超微结构。结果表明,氨氮胁迫对三疣梭子蟹血淋巴氨含量、鳃组织中NKA与H+-ATP酶活力以及各转运蛋白通道基因表达水平有显著性影响。血淋巴氨含量在氨氮胁迫下均显著增加,其中1 mg/L NH4Cl处理组中血氨含量逐渐增加,并于24h后达到稳定状态,5 mg/L NH4Cl处理组中血氨含量在实验期间内呈峰值变化,于24h达到最大值。鳃组织中NKA与H+-ATP酶活力在实验期间内均呈峰值变化,且均在6h达到最大值。鳃组织中Rh蛋白与K+通道基因表达水平在氨氮胁迫下显著上调并呈峰值变化,且均于12h达到最大值;NKCC与NHE基因表达水平在氨氮胁迫下均显著下调,其中1mg/L与5mg/L NH4CI处理组中NKCC基因表达水平分别于6h、3h达到最小值,随后增加但始终低于对照组水平,NHE基因表达水平在前6h内显著下调,12h恢复至对照组水平,随后又显著下调。本文中的所有指标测定结果均与外界氨氮浓度呈明显的剂量效应。由此可见,三疣梭子蟹在氨氮胁迫下通过上调Rh蛋白、K+通道基因表达水平,下调NKCC、NHE基因表达水平及增加NKA活力共同将体内氨氮浓度维持在一个相对较低的水平,避免氨氮浓度过高对机体造成毒害影响。VAMP基因表达水平的增加、H+-ATP酶活的增强以及鳃组织超微结构的结果表明胞吐排氨机制可能也存在于三疣梭子蟹中。3三疣梭子蟹在氨氮胁迫下尿酸、尿素代谢途径与组织分布的研究本实验研究了氨氮胁迫对三疣梭子蟹氮代谢终产物代谢途径与组织分布的影响。结果表明,氨氮胁迫显著影响了各组织中黄嘌呤氧化酶(XO)、氨甲酰磷酸合成酶Ⅲ(CPSⅢ)、精氨酸酶(ARG)、尿酸酶(URI)的基因表达水平,尿酸与尿素含量以及鳃组织中尿素转运蛋白(UT)的基因表达水平。各处理组XO基因表达水平在肌肉和鳃组织中显著上调,而在肝胰腺中显著下调；各处理组肌肉和鳃组织中CPSⅢ和ARG基因表达水平均呈峰值变化,且均在12h达到最大值,肝胰腺中CPSⅡ和ARG基因表达水平在氨氮胁迫前期明显受到抑制,而分别在胁迫48h和24h后显著上调；各处理组URI基因表达水平在氨氮胁迫下的变化趋势与XO的具有一致性；各组织中均检测到微量的尿酸,但都仅在少数取样点与对照组水平相比有显著性变化,尿酸在各组织中的分布情况为：肌肉>血淋巴>鳃>肝胰腺；各组织中尿素含量在实验期间内与对照组水平相比呈显著性变化,在5mg/L NH4Cl处理组中其显著性变化更为明显,且其含量远高于尿酸在各组织中的含量,尿素在各组织中的分布情况为：血淋巴>鳃>肝胰腺≈肌肉；鳃组织中尿素转运蛋白(UT)基因表达水平在氨氮胁迫下显著上调。由此可见,在氨氮胁迫下三疣梭子蟹会将体内多余的氨转化为尿素和微量的尿酸来解除毒害作用,其中尿酸可能通过嘌呤核苷酸分解代谢产生,并多储存在肌肉组织中,而尿素则可能通过鸟氨酸-尿素循环途径产生,但不排除是通过精氨酸酶水解产生的可能性,同时,通过嘌呤核苷酸分解代谢产生的尿酸还可能会经URI分解形成尿素。在长时间的氨氮胁迫后各组织产生的尿素则可能释放至血淋巴通过鳃组织中的UT蛋白排出体外。