中草药南蛇藤,卫矛科南蛇藤属,药性辛温,有小毒,具有祛风、活血、解毒、消肿等功能。课题组前期研究发现,南蛇藤提取物(CelastrusOrbiculatus extracts,COE)具有较强的抗肿瘤活性,能抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡,但其分子机制还未完全明确。原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC),消化道最常见的恶性肿瘤之一,近年来发病率呈上升趋势,致死率在所有癌症中居第三位。目前采取以手术切除为主的综合治疗模式,但是愈后不佳。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)参与多种生理与病理过程,是细胞内许多重要信号转导通路的关键枢纽,其功能失调与肿瘤的发生发展紧密相关。为了研究南蛇藤提取物是否靶向mTOR发挥抗肿瘤活性,本文构建了过表达mTOR基因的人肝癌HepG2细胞株(记作HepG2/mTOR+细胞),加入不同浓度的南蛇藤提取物干预后,探讨COE对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响及机制。结果显示,与对照组相比,在一定浓度范围内,COE呈浓度依赖性地减少mTOR的表达,抑制人肝癌HepG2细胞的增殖,促进人肝癌HepG2细胞凋亡,其分子机制可能与南蛇藤提取物抑制mTOR相关信号转导通路有关。本研究内容共分四部分。第一部分人肝癌HepG2/mTOR+细胞株的构建目的:构建过表达mTOR蛋白的人肝癌HepG2细胞株。方法:体外培养人肝癌HepG2细胞株至对数期,利用分子生物学技术,将GV238-mTOR重组质粒转染至人肝癌HepG2细胞中,同时设阴性对照组和野生细胞对照组。24h后,倒置显微镜下观察细胞形态。收集细胞总蛋白,Western blot法检测人肝癌HepG2细胞中mTOR蛋白的表达量。结果:转染24 h后,倒置显微镜下观察,野生型细胞贴壁生长,呈梭形,细胞轮廓清晰,细胞壁光滑无突起,折光性良好,核质均匀。与之相比,大部分HepG2/mTOR+细胞形态无显著变化,少量细胞变圆。Western blot结果显示,与对照组相比,HepG2/mTOR+细胞中mTOR蛋白的表达水平显著增加。结论:成功构建了人肝癌HepG2/mTOR+细胞株。第二部分南蛇藤提取物对人肝癌HepG2/mTOR+细胞的影响目的:研究南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatus extracts,COE)对人肝癌HepG2/mTOR+细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移能力的影响。方法:对数期人肝癌HepG2/mTOR+细胞,加入不同浓度的COE(20,40,80,160,320 mg/L),以野生型细胞为阴性对照,2mg/LDDP为阳性对照。MTT法检测各组药物对人肝癌HepG2/mTOR+细胞增殖能力的影响;倒置显微镜及透射电镜观察形态学改变;流式细胞术检测药物对人肝癌HepG2/mTOR+细胞凋亡的影响;细胞划痕法检测药物对人肝癌HepG2/mTOR+细胞爬行能力的影响;Transwell实验研究细胞侵袭迁移的变化。结果:与野生型细胞相比,HepG2/mTOR+细胞的增殖、侵袭及迁移能力明显增强。与未加药组相比,在一定浓度范围内,COE能抑制人肝癌HepG2/mTOR+细胞的增殖、侵袭及迁移,促进其凋亡,并呈明显的浓度依赖性。结论:mTOR的表达水平与肿瘤细胞的恶性行为相关。COE能降低mTOR的表达水平,抑制人肝癌HepG2细胞的增殖、侵袭及迁移,并促进肿瘤细胞凋亡。第三部分南蛇藤提取物促进人肝癌HepG2/mTOR+凋亡的分子机制目的:研究南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatus extracts,COE)对人肝癌HepG2/mTOR+细胞mTOR信号通路及凋亡相关蛋白表达水平的影响,初步探讨其分子机制。方法:对数期人肝癌HepG2/mTOR+细胞,为了避免细胞毒性作用的干扰,根据IC50的结果,加入不同浓度COE(20,40,80mg/L),同时设立野生细胞对照组和阳性药物对照组(2 mg/L DDP)。作用24 h后,Western blot法检测各组目的蛋白的表达水平。结果:COE抑制人肝癌HepG2/mTOR+细胞中mTOR蛋白的表达,呈浓度依赖性。COE能降低凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-2L12的表达,同时增加Bax、Caspase-3的表达量,呈浓度依赖性。随着药物浓度的增加,COE降低mTOR信号转导通路相关蛋白的表达量,尤其是明显降低4E-BP1、p-4E-BP1、P70和p-P70蛋白的表达水平。结论:COE促进人肝癌HepG2/mTOR+细胞凋亡,其作用机制可能与mTOR信号转导通路及Bcl-2凋亡蛋白家族有关。第四部分南蛇藤提取物与雷帕霉素联合应用的疗效比较目的:比较南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatus extracts,COE)与mTOR的抑制剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)联合应用对人肝癌HepG2/mTOR+细胞的影响。方法:对数期人肝癌HepG2/mTOR+细胞,分为COE组(80mg/L)、RAPA组(100 nmol/L)、COE+RAPA组,同时设立野生型细胞对照组和阴性药物对照组。24h后,倒置显微镜及透射电镜观察细胞形态学改变;流式细胞术检测各组药物对人肝癌HepG2/mTOR+细胞凋亡的影响;Western blot法检测各组目的蛋白的表达水平。结果:与未加药阴性对照组相比,COE或RAPA均能抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡。与单独使用COE或RAPA的治疗组相比,COE和RAPA的联合治疗显示出一定的协同效应。结论:COE与雷帕霉素联用可进一步促进肿瘤细胞凋亡。