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水稻病毒病是对水稻生产危害最严重的病害之一,严重影响了水稻的产量和品质。其中,水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)和水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)是对水稻危害最为严重的两种病毒,两者均通过灰飞虱(Laodelphax striatellus)传播。植物病毒与介体昆虫之间相互作用的研究是分析介体传毒机制,控制病毒传播的主要手段。RBSDV的非结构蛋白P9-1在病毒侵染过程中形成病毒原质结构(毒质,viroplasm),可能对病毒的复制和侵染具有非常重要的作用。本研究以灰飞虱和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)为实验材料,以RBSDV的P9-1为诱饵蛋白筛选灰飞虱的cD NA文库,并对筛选到的可能参与介体传毒的26S蛋白蛋白酶体亚基Rpn8进行功能验证,对Rpn8发挥作用的分子机理进行初步分析。主要结果及结论如下:(1)P9-1定位于细胞质。通过亚细胞定位分析发现P9-1定位于细胞质,且呈毒质形式存在。(2)RBSDV的病毒蛋白P9-1与灰飞虱26S蛋白酶体亚基Rpn8互作。病毒与介体昆虫蛋白的互作研究是了解介体传毒机制的主要方法,因此,我们以P9-1为诱饵蛋白钓取灰飞虱的cD NA文库,并获得了包括Rpn8在内的11个可能与P9-1互作的蛋白。有研究表明,26S蛋白酶体参与调控病毒在介体灰飞虱中的传播,而Rpn8是26S蛋白酶体的一个亚基,所以,我们以Rpn8为主要研究对象,并通过免疫共沉淀(Co-IP)以及双分子荧光互补(BiFC)实验证明了Rpn8确实与P9-1互作。(3)Rpn8负调控灰飞虱中RBSDV的积累。为检测Rpn8是否参与调控病毒传播,体外合成ds Rpn8并饲喂带毒灰飞虱以下调Rpn8的表达。发现灰飞虱体内RBSDV的外壳蛋白编码基因CP的表达水平升高,说明灰飞虱体内的病毒积累量增加。将Rpn8 RNAi转基因水稻接种带RBSDV的灰飞虱,发现转基因水稻的感病率高于野生型。表明Rpn8下调表达有利于灰飞虱中RBSDV的积累与传播。(4)RBSDV抑制灰飞虱26S蛋白酶体功能。qRT-PCR实验结果表明带RBSDV的灰飞虱中Rpn8的表达量显著低于无毒灰飞虱;Western blot实验结果显示带毒灰飞虱中泛素化蛋白积累量高于无毒灰飞虱,说明RBSDV可能通过降低Rpn8的表达从而影响灰飞虱26S蛋白酶体的功能。(5)灰飞虱26S蛋白酶体亚基Rpn8与Rpn7互作。酵母双杂交(Y2H)实验、荧光素酶互补实验(LCI)以及体外免疫共沉淀(pull-down)实验表明Rpn8与灰飞虱中26S蛋白酶体另一个亚基Rpn7互作,且P9-1与Rpn7不互作。(6)Rpn8亦与RSV的P2蛋白互作。qRT-PCR结果显示,带RSV的灰飞虱中Rpn8的表达量亦低于无毒灰飞虱,说明RSV可能通过降低Rpn8的表达调控26S蛋白酶体功能。Rpn8的下调促进灰飞虱中RSV的积累并且Rpn8 RNAi转基因水稻对RSV的感病率增加,说明Rpn8负调控灰飞虱中RSV的积累与传播。之后我们通过Y2H实验发现Rpn8与RSV的P2蛋白互作,LCI和Co-IP实验进一步证明两者互作。以上结果表明RSV通过干扰灰飞虱26S蛋白酶体功能促进病毒积累的作用机制与RBSDV相类似。综上所述,RBSDV可能通过降低Rpn8的表达从而调控灰飞虱26S蛋白酶体功能,促进病毒在灰飞虱中的积累。已知26S蛋白酶体各组分间的互作决定其功能发挥,而本研究证明灰飞虱中Rpn8与Rpn7互作、病毒蛋白P9-1与Rpn8互作,而P9-1与Rpn7不互作。因此我们推测RBSDV还可能通过P9-1影响Rpn8与Rpn7的互作抑制灰飞虱26S蛋白酶体功能,从而促进其在灰飞虱体内的积累,具体机制有待进一步研究。