【摘 要】
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目的:通过建立microRNA-1(miR-1)基因敲除的斑马鱼模型,探究miR-1对神经嵴细胞(neural crest cells;NCCs)分化及功能的调控机制。方法:采用CRISPR/Cas9技术,获得miR-1基因敲除的斑马鱼模型,以同一品系野生型斑马鱼(wide type;WT)作为对照组。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction;PCR)电泳技术验证miR-
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目的:通过建立microRNA-1(miR-1)基因敲除的斑马鱼模型,探究miR-1对神经嵴细胞(neural crest cells;NCCs)分化及功能的调控机制。方法:采用CRISPR/Cas9技术,获得miR-1基因敲除的斑马鱼模型,以同一品系野生型斑马鱼(wide type;WT)作为对照组。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction;PCR)电泳技术验证miR-1敲除纯合子斑马鱼的稳定获得。原位杂交技术观测miR-1在斑马鱼胚胎中的原始表达。体视显微镜观察实验组和对照组的形态学差异。阿尔新蓝软骨染色观察胚胎在4天(4 days past fertilized;4dpf)时的软骨形态变化。原位杂交技术观测两组发育至24小时(24 hours past fertilized;24hpf)的斑马鱼的神经嵴细胞迁移及分化等的变化。TUNEL染色探究miR-1对NCCs凋亡的影响。最后利用逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcriptionpolymerase chain reaction;RT-PCR)检测凋亡信号分子的变化情况。结果:PCR电泳验证了亲代斑马鱼miR-1完全敲除。原位杂交结果显示miR-1在斑马鱼发育至24hpf表达最强,且在头部高表达。体视显微镜观测到实验组在4dpf时出现心脏水肿,下颌后缩等状况,同时眼部虹膜色素减少。阿尔新蓝染色结果表明,实验组斑马鱼的舌弓和麦氏软骨相对后缩,且具有统计学差异。原位杂交结果示,miR-1的敲除主要影响了NCCs的分化和迁移。TUNEL染色结果表明实验组斑马鱼头部的凋亡细胞显著增多。RT-PCR结果显示实验组凋亡因子caspase-3显著增加,同时抗凋亡因子Bcl-2明显减少。提示miR-1主要通过影响神经嵴细胞的迁移分化和凋亡而影响神经嵴细胞功能。结论:microRNA-1通过调控神经嵴细胞的分化及凋亡进而影响颅面发育
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