背景:心肌梗死(MI)严重威胁着人类的健康。近十余年,基质干细胞(MSCs)疗法为治疗MI带来了新的希望。MSCs可以起到改善病理性心室重塑,增强心脏功能,促进疾病恢复的治疗作用。大量实验证据表明MSCs的治疗能力主要来源于旁分泌机制。MSCs可以在MI部位分泌大量的生物活性因子,调节MI后的病理过程。近期,色素上皮衍生因子(PEDF)被鉴定出是MSCs分泌的一种主要的多功能细胞因子。然而,MSCs分泌的PEDF在其对MI的治疗过程中所发挥的作用目前尚未报道。在临床试验中自体MSCs移植治疗MI的确切效果尚不肯定。MI患者多为老年人,所以治疗应用的MSCs多来源于衰老的个体。目前对衰老是通过怎样的机制影响MSCs对MI的疗效仍不清楚。在预实验中我们发现来源于衰老个体的MSCs的PEDF表达、分泌显著增高。基于以上理论与新的发现我们提出如下假说:PEDF在MSCs对MI的病理调控过程中可能起着十分重要的作用,并且PEDF的年龄相关性表达对MSCs的治疗效力有非常重要的影响。目的:探讨MSCs分泌的PEDF在MI病理过程中的调控作用,以及来源于衰老个体的MSCs高表达PEDF对其治疗效力的影响。试图找到新的基因靶点对衰老的MSCs进行干预从而改善MSCs的治疗效果。方法:(1)MSCs的分离、培养与鉴定:分别分离、培养来源于8w大C57BL/6小鼠(年轻)或18m大C57BL/6小鼠(衰老)的骨髓MSCs至第三代,对培养细胞的细胞标志物进行流式细胞仪分析,并做成脂、成骨诱导分化实验对MSCs进行鉴定。(2)年轻MSCs与衰老MSCs的增殖与趋化能力的初步比较以及PEDF的表达、分泌差异检测:MTT实验分析年轻MSCs与衰老MSCs在低氧或常氧条件下的增殖能力,使用Transwell系统测试两种细胞受基质细胞衍生因子-1(SDF-1)趋化的移行能力,并通过流式细胞仪分析SDF-1的受体CXCR4的表达。行RT-PCR检测年轻MSCs或衰老MSCs的PEDF的mRNA表达,ELISA实验检测年轻MSCs或衰老MSCs条件培养基中PEDF含量。(3)腺病毒载体的构建以及MSCs的病毒转导:构建表达人源性PEDF并含报告基因GFP的E1、E3缺陷人类5型腺病毒(adenovirus, Ad)载体,仅含GFP报告基因的空腺病毒载体(Ad.Null)作为对照;以及特异性对小鼠源性PEDF干涉的发夹状RNA(shRNA)腺病毒载体(含GFP报告基因),含GFP报告基因的乱码shRNA腺病毒载体作为对照(Ad.shctrl)。腺病毒载体转导体外培养的MSCs(MOI值3000),倒置荧光显微镜观察及流式细胞仪测定感染效率,ELISA检测体外人源性或小鼠源性PEDF表达情况。(4)小鼠MI模型的建立与细胞注入:建立8w大小鼠的MI模型,在手术后0.5-1h通过尾静脉注入生理盐水、年轻MSCs、衰老MSCs,年轻MSCs转导Ad.Null(Y&Ad.Null)、年轻MSCs转导Ad.PEDF ( Y&Ad.PEDF )、衰老MSCs转导Ad.shPEDF(O&Ad.shPEDF)或衰老MSCs转导Ad.shctrl(O&Ad.shctrl)各4.0×10~6。(5)检测MSCs的趋化和PEDF在体内的表达:将MI小鼠的心脏、肝脏、脾脏以及肺组织制作成8μm的冰冻切片,进行HE染色或在荧光显微镜下观察GFP阳性的MSCs在各脏器中的滞留情况。另外收集MI小鼠的骨髓细胞与外周血,常规裂解红细胞后行流式细胞仪检测GFP阳性的MSCs所占比例。MI后心脏组织冰冻切片行人源性PEDF或小鼠源性PEDF的免疫荧光染色,观察PEDF在MI部位的表达情况。切下MI区域组织,匀浆后进行人源性PEDF或小鼠源性PEDF的ELISA检测,进一步观察PEDF在MI部位的表达情况。(6)分析MI部位的细胞表型:MI后对心脏组织冰冻切片行CD31、αSMA, vimentin, cardiac troponin I,或F4/80免疫荧光染色,观察分别注入各组MSCs后MI部位的血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞、心肌细胞或巨噬细胞的数量变化。(7)测量左室纤维瘢痕面积以及心脏功能:对MI后心脏标本行Masson染色,检测注入各组MSCs后心脏纤维瘢痕面积。对小鼠行右侧颈动脉插管,检测MI小鼠血流动力学与心功能指标。(8)MSCs与心脏成纤维细胞(CFs)共培养实验:分离培养C57BL/6小鼠的CFs,分别将年轻MSCs、衰老MSCs、Y&Ad.Null、Y&Ad.PEDF、O&Ad.shPEDF或O&Ad.shctrl与CFs在Transwell系统中共培养、另外CFs与CFs共培养作为对照,检测MSCs分泌的PEDF对CFs的增殖、趋化作用。(9)PEDF对CFs的直接作用:观察0-200ng/ml的PEDF对CFs的增殖、细胞周期、cyclin D1与P27的表达、凋亡以及趋化的作用。增殖分析使用MTT实验,细胞周期检测通过流式细胞仪、cyclin D1与p27的表达使用western blot,凋亡检测通过流式细胞仪和Hoechst染色,趋化实验使用Transwell系统。(10)统计方法:所有数据均表示为均数±标准误.多组比较首先使用单因素方差分析,后续检验使用LSD-t检验。两组比较使用Student-t检验。所有统计使用SPSS 11.5软件。P值小于0.05被认为有统计学意义,采用双侧检验。结果:(1)来源于衰老个体的MSCs的PEDF表达、分泌显著增高:实验结果表明体外培养的第三代年轻MSCs或衰老MSCs均可以分化为成骨细胞与脂肪细胞,并且高表达CD29, CD44, CD73, CD90和CD105,但低表达CD11b, CD34和CD45。年轻MSCs与衰老MSCs在常氧或低氧下的增殖能力以及其向SDF-1诱导的移行能力没有显著差异,SDF-1的受体CXCR4在两种细胞的表达也没有明显差异。但是RT-PCR与ELISA实验表明衰老的MSCs在低氧或常氧条件下PEDF的表达、分泌显著增高。(2)构建的腺病毒载体可以较高效的感染MSCs,并可得到理想的过表达或干涉效果:倒置荧光显微镜或流式细胞仪检测发现,腺病毒载体对MSCs的感染效率均高于75%。年轻的MSCs感染Ad.PEDF后可在体外表达、分泌人源性PEDF至少一周,分泌高峰为感染后第二天。衰老MSCs感染Ad.shPEDF后,其内源性的小鼠PEDF表达被显著抑制,抑制效应可至少维持8d。所有对照组MSCs的PEDF表达没有显著变化。(3)经外周静脉注入的MSCs可较为特异的趋化至MI区域:我们发现MI后经尾静脉注入的GFP阳性MSCs少量存在于肺、肝、脾与外周血中,在骨髓细胞中的外源性GFP阳性MSCs有一过性的升高,但迅速回落。注入的MSCs主要位于MI区域与MI周围区域。(4)注入各组MSCs后MI区域内的PEDF表达:免疫荧光与ELISA结果表明,与注入生理盐水相比,注入年轻的MSCs与衰老的MSCs都可以使MI区域的PEDF含量下降。但是与注入年轻的MSCs相比,注入衰老的MSCs后MI区域的PEDF含量显著增高。只有注入Y&Ad.PEDF后可以在MI部位检测到人源性PEDF。另外,与注入O&Ad.shctrl相比,注入O&Ad.shPEDF后MI区域的PEDF含量显著下降。(5)衰老MSCs对MI的治疗效力减低与其高表达PEDF密切相关:MI后心脏Masson染色以及心功能检测结果表明,与注入生理盐水相比,年轻的MSCs与衰老的MSCs均可以显著的缩小梗死后纤维瘢痕面积,改善心脏功能。但是与年轻的MSCs相比,衰老的MSCs的治疗效力显著下降。当年轻的MSCs过表达PEDF后,其对MI的治疗效力显著受损。当衰老的MSCs的PEDF表达被干涉后,其对MI的治疗效力显著改善。(6)MSCs可通过分泌PEDF调节MI部位的细胞成份:免疫荧光结果显示,与注入生理盐水相比,年轻的MSCs与衰老的MSCs都可以显著的增加梗死部位的血管内皮细胞、血管平滑肌细胞以及巨噬细胞的数目,减少成纤维细胞的数目。但是与注入年轻的MSCs相比,注入衰老的MSCs可致梗死部位含有更多的成纤维细胞,而较少的血管内皮细胞、血管平滑肌细胞与巨噬细胞。此外,当年轻的MSCs过表达PEDF后,可使MI部位的细胞表型类似于注入衰老的MSCs;而当衰老的MSCs的PEDF表达被干涉后,可致MI部位的细胞表型类似于注入年轻的MSCs。(7)MSCs通过分泌PEDF调控CFs的生物学行为:Transwell实验显示,年轻的MSCs与衰老的MSCs都可以抑制CFs的增殖。但是与年轻的MSCs相比,衰老的MSCs的抑制作用显著下降。另外,当年轻的MSCs过表达PEDF后其对CFs增殖的抑制作用下降;而当衰老MSCs的PEDF表达被干涉后,其对CFs增殖的抑制作用得到改善。MTT实验结果表明,PEDF本身可促进CFs在低氧条件下的增殖,并呈现剂量依赖性。200ng/ml的PEDF可显著的增加CFs在S期的细胞数量,并上调cyclin D1与下调P27的表达。而PEDF对CFs的凋亡没有明显作用。另外,衰老MSCs较年轻MSCs对CFs有更强的趋化作用,当衰老MSCs的PEDF表达被干涉后这种趋化作用减弱,而年轻MSCs过表达PEDF后,其对CFs的趋化作用显著增强。Transwell实验结果显示PEDF本身对CFs有较强的趋化作用。结论:(1)与静脉注入来源于年轻个体的MSCs相比,静脉注入来源于衰老个体的MSCs可使MI部位的细胞成份发生变化,对MI的疗效显著下降。(2)与来源于年轻个体的MSCs相比,来源于衰老个体的MSCs表达、分泌PEDF显著增加。(3)MSCs可以通过分泌PEDF调控MI的病理过程。MSCs分泌的PEDF可作用于MI部位包括血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞与心脏成纤维细胞在内的多种细胞类型,影响他们的生物学行为。(4)衰老MSCs的PEDF的高表达是造成其对MI疗效下降和MI部位细胞成份变化的重要原因。(5)使用基因工程手段抑制衰老MSCs的PEDF表达可以显著的提高对MI的治疗效力。PEDF可作为一个新的基因靶点用以提高衰老MSCs的治疗效果,为MSCs的临床应用提供了新的思路。