论文部分内容阅读
1. 异育银鲫尾鳍细胞系的建立及其对CyHV-2的敏感性研究 本实验中，我们建立了异育银鲫尾鳍细胞系，命名为GiCF。原代培养的GiCF细胞形态多样，主要呈上皮样细胞和纤维样细胞的特点，稳定传代后细胞呈纤维样细胞的特点。该细胞系在20-30℃温度范围内均可生长，最适生长温度为25℃。染色体数目分布在 140-166 之间，有 35%的中期分裂相的染色体纵数在 156，3 n=156为三倍体。用从患病异育银鲫肾脏和脾脏中提取的病毒悬液感染GiCF细胞， 7天后细胞出现明显的病变现象，细胞收缩、变圆、脱落和细胞质空泡化；感染9天后，病变现象更加明显，出现大量的细胞脱落现象。用传至20代的CyHV-2感染细胞，细胞病变情况更加严重，感染7天后，细胞大量脱落、死亡，证明GiCF细胞对CyHV-2敏感，可用于CyHV-2的增殖。另外，CyHV-2感染GiCF细胞后出现明显的凋亡小体，TUNEL染色也能观察到明显的凋亡阳性信号，AnexinⅤ/PI染色结果表明病毒感染后发生凋亡细胞的数量显著上升。说明CyHV-2感染能引起GiCF细胞产生凋亡。 2. CyHV-2感染异育银鲫mRNA转录组和小RNA转录组研究 利用Illumine Hiseq 2500测序平台构建了健康组（T1K，T2K，T3K）和濒死组（T4K，T5K，T6K）异育银鲫肾脏的6个mRNA文库和6个sRNA文库。6个mRNA转录组文库中，共获得564,633,312纯净reads，经Trinity拼接一共获得了20,386条平均长度为647 bp的unigene。6个sRNA文库中，共获得9,652,774纯净reads，经比对分析得到888个成熟的miRNA ，其中48个为新发现的miRNA ，且这些新发现的miRNA表达量相对较低。对所有的miRNA进行差异表达分析，有23个差异表达miRNA（P < 0.01），其中8个miRNA表达量显著上调，15个miRNA显著下调。用qRT-PCR实验验证显著差异表达的miRNA，表达变化趋势与测序结果基本一致。最后，对显著差异表达的miRNA进行靶基因预测，大部分miRNA有多个靶基因，一个靶基因可能受到多个miRNA共同调控，这些靶基因参与多种信号途径，如Jak-STAT信号通路、B细胞受体信号通路、凋亡和MAPK信号通路等。 3. CyHV-2编码miRNA的鉴定及功能分析 利用小RNA转录组数据，结合CyHV-2基因组信息，分析得到17条CyHV-2编码的miRNA，这些miRNA的前体具有良好的发卡结构。CyHV-2编码miRNA在病毒基因组上主要成簇状分布在两个区域，其中一个位于 ORF42 附近，包括miR-C3，miR-C4，和 miR-C5，另外一个区域位于ORF114附近，包括miR-C1， miR-C15，和miR-C16。在CyHV-2感染过程，使用qRT-PCR检测肾脏组织中CyHV-2的拷贝数，发现感染后病毒拷贝数持续升高，感染72 h时病毒的拷贝数达到107.6 copies/ml。随着CyHV-2感染的进行，PIN1和NF-κB的mRNA表达显著下降，而MHC-I, IRF3和 MAPK7基因的mRNA表达显著上调。随后我们利用Stem-loop qRT-PCR检测到除了miR-C3，miR-C8，miR-C16之外的14个病毒miRNA，其中miR-C4和miR-C5表达量最高；利用Northern blot检测8个丰度较高的miRNA时，检测到所有的8个pre-miRNA，只检测到miR-C4和miR-C5 2个miRNA的成熟体。利用荧光素酶报告系统证明miR-C4能与ORF4、IRF3、RBMX和PIN1基因的3′UTR区域直接结合，而IRF3、RBMX和PIN1是RIG-I信号通路上的重要基因，我们推测CyHV-2通过编码miRNA参与调控RIG-I信号通路，从而逃避宿主的免疫反应。 4. miR-C12通过下调caspase 8的表达抑制CyHV-2诱导的细胞凋亡 既然 CyHV-2 能够诱导 GiCF 细胞发生凋亡，我们希望探讨 CyHV-2 编码的miRNA是否参与调控细胞凋亡。将8条表达丰度较高的miRNA mimics转染至GiCF细胞后，发现miR-C10 和 miR-C12抑制 CyHV-2 诱导的 GiCF细胞凋亡， miR-C4促进CyHV-2诱导的GiCF细胞凋亡。通过生物信息学预测及双荧光素酶报告实验，证明miR-C12靶向抑制内源及外源表达的caspase 8基因。CyHV-2感染GiCF细胞后，caspase 8 mRNA和蛋白表达水平都显著上调，感染6 h后即可检测到miR-C12，且表达量随着感染时间的延长而增高。然后我们分别用siRNA或Z-IETD-FHM抑制caspase 8，都能下调CyHV-2诱导的细胞凋亡。CyHV-2感染后，再转染miR-C12 mimics将导致GiCF细胞的凋亡水平显著下调，转染miR-C12 inhibitor导致GiCF细胞凋亡水平显著上调。以上结果表明，在感染过程中，CyHV-2通过编码miR-C12抑制细胞凋亡。为进一步探讨miR-C12在病毒侵染过程中的调控机制，将miR-C12 mimics，miR-C12 inhibitor，CASP-siRNA-1和相应的对照物转染细胞，结果显示转染miR-C12 mimics和CASP-siRNA-1均能促进CyHV-2的复制，转染miR-C12 inhibitor抑制CyHV-2的复制。由此我们推测CyHV-2通过编码miR-C12抑制病毒诱导的细胞凋亡，进而促进病毒在细胞内复制。