【摘 要】
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目的:本研究旨在探讨在骨性关节炎患者中,新型机械激活离子通道Piezo1蛋白是如何通过NF-κB信号通路介导软骨细胞凋亡的机制过程。方法:收集骨性关节炎患者关节软骨标本,进行体外分离培养,利用Flexcell公司的细胞周期牵张应力加载系统模拟OA患者体内生物力学的改变,针对该系统作用于软骨细胞的时间不同,分为空白组（0h机械牵张应力组）,各加力组（12h,24h和48h机械牵张应力组）,抑制剂组（
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目的:本研究旨在探讨在骨性关节炎患者中,新型机械激活离子通道Piezo1蛋白是如何通过NF-κB信号通路介导软骨细胞凋亡的机制过程。方法:收集骨性关节炎患者关节软骨标本,进行体外分离培养,利用Flexcell公司的细胞周期牵张应力加载系统模拟OA患者体内生物力学的改变,针对该系统作用于软骨细胞的时间不同,分为空白组（0h机械牵张应力组）,各加力组（12h,24h和48h机械牵张应力组）,抑制剂组（NF-κB信号通路特异性抑制剂PDTC组和piezo1特异性抑制剂GsMTx4组）,抑制剂组也分为上述的各个加力组。利用倒置光学显微镜观察细胞生长的形态特征和加力后各个分组不同时期的细胞形态变化,利用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,利用RT-PCR对Piezo1、P65、基质金属蛋白酶MMP-13、Ⅱ型胶原（Col-Ⅱ）、caspase-3、凋亡相关基因Bcl-2、Bax基因相对表达量检测,并利用Western-blot法分析Piezo1蛋白的表达水平。结果:（1）在倒置显微镜下观察各组的细胞形态,发现12h机械应力组的凋亡小体的数目较空白组明显增加,24h机械应力组的凋亡小体的数目较12h机械应力组的也上升明显,但48h的机械应力组的凋亡小体的数目较24h的机械牵张应力组的有所下降:同样piezo1特异性抑制剂GsMTx4组的各个加力组的细胞凋亡小体的数目均少于无抑制剂组,但趋势与无抑制剂组的大体相同。（2）Real-time荧光定量PCR检测结果显示:Pizeo1基因在空白组有少量表达,12h单纯机械牵张应力组与0h相比升高,24h单纯机械牵张应力组与12h单纯机械牵张应力组相比明显升高,并且其表达量达到最大值,但单纯机械牵张应力作用于48h的软骨细胞与作用24h相比,Piezo1m RNA相对表达量有了明显下降（P<0.05）。同样的P65,BAX,Caspase-3,的m RNA相对表达量和Piezo1有相同的趋势（P<0.05）。Bcl-2m RNA表达量的趋势与上述基因正好相反。抑制剂GsMTx4组和抑制剂PDTC组的P65,Caspase-3,和Bax的m RNA相对表达量的趋势与单纯机械牵张应力组相似,但表达量均有不同程度下降（P<0.05）。而抑制剂组的Bcl-2基因相对表达量与其相对应的单纯加力组相比均升高（P<0.05）。同时我们发现Piezo1基因的相对表达量在抑制剂GsMTx4组中均有不同程度的下降,但在抑制剂PDTC组中没有变化,即PDTC不能抑制Piezo1的表达。我们还检测了软骨基质降解相关基因（MMP-13、Col-Ⅱ）的表达,结果发现MMP-13基因相对表达量和Piezo1有相同的趋势,而Col-Ⅱ基因表达正好与上述趋势相反（P<0.05）。（3）Western-blot蛋白分析结果显示Piezo1蛋白在单纯机械应力作用于12h的软骨细胞组较空白组来说,其表达量增加（P<0.05）,作用于24h的软骨细胞组与作用于12h组相比,Piezo1蛋白表达量明显增加,且达到高峰,但单纯机械应力作用于48h的软骨细胞组与作用于24h组相比,Piezo1蛋白的表达量明显下降（P<0.05）。抑制剂GsMTx4组的各加力组piezo1蛋白的表达量均低于无抑制剂组的表达量,但各个加力组的趋势与无抑制剂组的大体相同。并且P65蛋白的表达量与Piezo1蛋白的表达趋势相同。（4）流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示:12h机械牵张应力组与空白组相比,软骨细胞的晚期调亡率明显增加,24h机械牵张应力组晚期细胞凋亡率最高,48h机械牵张应力组晚期凋亡率比24h机械牵张应力组降低（P<0.05）。并且抑制剂GsMTx4组与其相对应单纯机械应力组相比,其凋亡率都有不同程度下降。（5）RT-PCR检测结果和蛋白印迹分析结果均表明,Piezo1、P65、Bax、caspase-3的表达量与细胞晚期凋亡具有相同的趋势。结论:新型机械激活离子通道Piezo1蛋白在软骨细胞晚期凋亡中发挥重要作用,并通过NF-κB信号通路介导软骨细胞凋亡。此外,实验发现Piezo1蛋白也参与了软骨基质降解的过程。
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