研究背景糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是指发生于糖尿病患者的一种以心肌结构和功能异常为主要表现的特异性心肌病,它独立于冠心病、高血压病、心脏瓣膜病等心脏病变,是糖尿病患者死亡的主要原因之一。其病理特征包括：心肌细胞肥大、变性、灶性坏死,心肌细胞外间质胶原沉积及纤维化等。临床表现为心脏舒张和/或收缩功能障碍,易并发心力衰竭、心律失常甚至猝死。DCM常始于一段临床潜伏期,治疗往往被延迟和忽视,导致预后不良。探讨其发病机制将为DCM的早期干预及延缓病情进展提供可能。DCM的确切发病机制还不清楚,它涉及多种因素的共同参与包括高血糖、高胰岛素血症、异常脂肪酸代谢、氧化应激、心脏自主神经病变和局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统的过度激活等。自噬(autophagy)是细胞回收细胞质和处理多余的或有缺陷的细胞器的过程,在健康和疾病中起着至关重要的作用。鉴于糖尿病是一种代谢紊乱性疾病,而自噬是体内的主要平衡机制可消除受损的细胞器、长寿或异常蛋白质和细胞质的多余的部分,因此推测自噬在体内营养平衡和糖尿病的发展中起着不可或缺的作用。研究证实,自噬可加速游离脂肪酸及晚期糖基化产物(advanced glycation end products, AGEs)的分解、改善心肌缺氧和代谢紊乱、减少氧化应激(oxidative stress, OS)、缓解胰岛素抵抗(insulin resistance, IR),因此在维持心肌细胞稳态以及改善糖尿病患者的心功能方面发挥重要作用。硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是继一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)之后的第3种新型气体信号分子。研究表明,内源性H2S参与了许多心血管系统的生理与病理生理过程。在DCM模型中,腹腔注射或口服H2S可以对抗心肌肥厚,改善糖尿病心脏组织学改变,降低纤维化的程度,并改善了糖尿病状态。在体外研究中同样发现,H2S可减轻高糖诱导的心肌细胞损伤。其机制主要包括：抗炎、抗氧化以及抗细胞凋亡。然而,H2S对糖尿病心肌损伤的保护作用是否通过调节心肌细胞自噬实现,目前尚未见相关报道。本研究采用高脂喂养+小剂量链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型,在体内探讨自噬在糖尿病心肌病中的作用及H2S的干预研究。研究目的1.构建2型DCM大鼠动物模型；2.明确自噬相关因子在2型DCM大鼠心肌内的表达；3.探讨H2S对DCM的保护作用是否通过调节心肌细胞自噬实现。研究方法1.构建2型糖尿病大鼠动物模型5周龄雄性SD大鼠34只,适应性喂养1周后随机分为2组：对照组(N=10只)和糖尿病模型组(N=24只)。对照组大鼠喂以基础饲料,糖尿病模型组大鼠喂以高脂饲料。4周后行腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)和腹腔胰岛素耐量试验(IPITT),对经高脂喂养后出现胰岛素抵抗的大鼠一次性给予腹腔注射STZ 40mg/kg。STZ注射1周后,测定FBG≥11.1mmol/L者认为糖尿病模型构建成功。糖尿病模型组再次分为糖尿病对照组(DM组,N=12)和NaHS (H2S的外源性供体)治疗组(DM+NaHS组,N=12)。NaHS+DM组予以腹腔注射NaHS溶液14μmol/(kg · d)。给药6周后处死大鼠,留取标本。2.实验末进行以下检测：(1)血清学指标检测包括：各组大鼠禁食过夜,收集外周静脉血检测空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)及空腹胰岛素(FINS)水平等,计算胰岛素敏感指数(ISI)。(2)血压和心率的测量：利用大鼠尾动脉血压测量仪测量大鼠尾动脉收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均动脉压(MBP)和心率(HR),每只大鼠测量3次取平均值。(3)超声心动图：分别测量左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室短轴缩短率(FS)并计算左室射血分数(LVEF)；测量二尖瓣舒张早期血流速度峰值(E)和舒张晚期血流速度峰值(A)、E/A比值、E波减速时间(EDT)；等容舒张时间(IVRT)。依此来评价各组大鼠的左室舒张及收缩功能。(4)组织形态学分析：通过HE和Masson染色,分别观察心肌的形态结构和心肌内胶原的分布情况,定量分析心肌组织胶原含量,评价心肌纤维化程度。(5) TUNEL染色：取各组大鼠的心脏组织切片行TUNEL染色检测心肌细胞的凋亡率。(6) Western blot检测：提取各组大鼠的心肌组织蛋白,Western blot检测心肌组织内Bax、Bcl-2、LC3、Atg5的蛋白表达。所有数据用SPSS 17.0统计软件进行分析,连续变量以均数±标准差(Mean ±SD)表示,以p<0.05为差异具有统计学意义。研究结果1.实验动物基本情况实验中观察,与对照组(NC组)大鼠相比,糖尿病模型组大鼠出现多食、多饮、多尿和消瘦等症状。整个实验过程中有3只大鼠死亡,其中DM组死亡2只,DM+NaHS组死亡1只,最终共31只大鼠完成实验,NC组10只,DM组10只,DM+NaHS组11只。2.各组大鼠血压、心率及代谢指标变化与NC组相比,DM组大鼠的FBG、TG、TC和FINS水平明显升高,ISI显著降低(p<0.05)。与NC组相比,DM组大鼠的HR明显上升(p<0.05),三组大鼠的SBP、DBP监测未见明显统计学差异。NaHS干预后能显著改善DM大鼠的代谢异常和受损的胰岛素敏感性(p<0.05),同时可使DM大鼠的HR显著下降(p<0.05)。3.各组大鼠左室结构及功能指标的变化DM组大鼠的心重／体重比值(HW/BW)较NC组显著增加(p<0.05)。HE染色示DM组大鼠的左室室壁增厚,心肌细胞肥大、扭曲,排列紊乱,间隙增大,细胞核大小不甚规则。Masson染色显示：与NC组相比较,DM组大鼠的心肌间质胶原沉积显著增加,胶原纤维排列紊乱。与DM组相比,NaHS干预后可显著降低HW/BW、心肌胶原纤维容积分数(CVF),差异均具有显著性(p<0.05)。超声心动图检测提示,与NC组相比,DM组大鼠在实验末表现为E/A显著降低(p<0.05),而EDT.IVRT显著升高(p<0.05),LVEF.FS变化无统计学差异(p>0.05),提示出现了左室舒张功能障碍,而收缩功能正常。NaHS干预后可显著改善糖尿病大鼠的左室舒张功能,表现为E/A较DM组显著升高(p<0.05),而EDT.IVRT显著降低(p<0.05)。4.凋亡水平在各组大鼠心肌组织的变化TUNEL染色结果显示：与NC组大鼠相比,DM组大鼠心肌细胞的凋亡率显著增加(p<0.05)；与DM组大鼠相比,NaHS干预组大鼠心肌细胞凋亡率显著降低(p<0.05)。Western blot示：与NC组相比,DM组大鼠心肌组织中Bax的表达显著增加(p<0.05),而Bcl-2蛋白的表达显著降低(p<0.05),提示凋亡水平增加,而经NaHS干预后可下调Bax表达同时上调和Bcl-2的蛋白表达,差异均具有显著性(p<0.05)。5.自噬相关因子在各组大鼠心肌组织的表达免疫组化染色显示(图5A),DM组大鼠较NC组相比,自噬相关蛋白Atg5在心肌组织内的表达明显降低,NaHS干预后Atg5的表达较DM组增加。Western blot检测显示,与NC组相比,DM组大鼠心肌组织中自噬相关蛋白Atg5和LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达水平显著降低(p<0.05)。而经NaHS干预后可明显上调DM大鼠心肌组织中Atg5和LC3-Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达水平(p<0.05)。结论1.通过高糖高脂喂养+腹腔注射STZ,成功建立了大鼠DCM模型,为DCM发病机制的研究提供了可靠的平台；2.在2型DCM早期,心肌内自噬水平被明显抑制,同时伴有左室重构及舒张功能减退;3.外源性H2S可改善DCM大鼠左室重构及功能障碍,其心肌保护作用与上调心肌细胞自噬、抑制凋亡有关。研究背景糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是指独立于冠心病、心脏瓣膜病、高血压病等以心肌细胞功能异常为特征发生于糖尿病病人的特异性心肌病。尽管DCM的病理机制复杂,高糖仍被认为是心肌损伤的主要致病因素。事实上,高糖的心肌毒性作用已在多种细胞和动物体内证实。高糖诱导的心肌细胞死亡与氧化应激的产生、细胞凋亡加速、线粒体损伤、心肌肥厚、钙稳态失衡及纤维变性有关。体外实验同样显示,在高糖诱导的心肌细胞损伤中,高糖可直接导致活性氧和凋亡水平的升高,以及自噬水平的下降。然而,DCM的潜在机制仍然未被完全揭示,目前临床治疗仍不能有效的减少DCM和心衰的发生。因此,我们合理地提出了一个分子机制,并期望其成为治疗DCM的新的治疗策略。近来,在DCM中失调的自噬功能和硫化氢(H2S)在高糖诱导的心肌细胞毒性中的作用已引起广泛关注。自噬是一种细胞内重要的分解代谢途径,细胞内的长寿蛋白、损伤的细胞器被转运至溶酶体内分解,从而使细胞在经历饥饿或其他各种应激反应时能维持自身稳态。通常的“巨自噬”称为“自噬”,它被严格的控制通过各种正向和负向调节。众所周知,在正常环境下,低水平的自噬是细胞应激的保护机制,然而,过度的自噬却能够导致细胞损伤。最近的研究证实,高水平的自噬可出现在细胞内压力过负荷、缺血再灌注损伤、心力衰竭、心肌梗死和心肌肥厚时,由此可见自噬在多种心脏疾病的发病机制中起重要作用。事实上,有证据显示自噬反应的变化能够促进心脏维持正常功能和形态。然而,自噬在DCM中的作用更复杂。比如,抑制自噬呈现出适应性特征在STZ糖尿病大鼠(1型糖尿病模型),相反却呈现适应不良的特征在HFD诱导的糖尿病大鼠(2型糖尿病模型)。尽管许多的研究已经发现自噬水平的变化在高糖诱导的心肌细胞毒性,但是其病理生理机制仍未完全揭示。H2S是同一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)一样,在生理和病理生理条件下具有抗氧化、抗凋亡、保护线粒体功能、抗炎等作用的一种新的气体递质。近年来,不断增加的证据显示H2S具有心脏保护作用。外源性的H2S已经在STZ大鼠模型中被证实可通过ROS信号通路减少心肌坏死,并且可以通过阻滞心肌细胞凋亡挽救异丙肾上腺素诱导的大鼠收缩功能。H2S是也可促进缺血后左室功能和线粒体呼吸在心肌缺血再灌注损伤后。近来,H2S是在DCM的保护作用吸引了很多研究者的注意。H2S延缓DCM的发展通过减弱氧化应激、凋亡和炎症。H2S还能减弱高糖诱导的心肌毒性作用在H9c2细胞。尤其,H2S能恢复心肌缺血再灌注损伤的自噬水平和逆转高脂抑制的自噬活性。这些发现让我们有理由猜测H2S可能是一个潜在的治疗手段在糖尿病相关的疾病。综上研究结论我们合理地提出了一个假设：自噬在H2S对糖尿病心肌损伤的保护机制中发挥重要作用。在第一部分的实验中,我们在糖尿病大鼠体内已证实了H2S对糖尿病心肌细胞受损的保护作用,并同时观察到自噬水平的上调,提示H2S对糖尿病心肌细胞受损的保护作用可能通过上调心肌细胞自噬实现。第二部分实验我们将体外模拟糖尿病发生,建立高糖诱导的人AC16心肌细胞毒性模型,进一步在细胞水平验证自噬在H2S减弱高糖诱导的心肌毒性作用中的机制,从而为DCM的治疗提供新的理论依据和治疗靶点。研究目的1.验证高糖诱导的人AC16心肌细胞的毒性作用；2.明确H2S对高糖诱导的人AC16心肌细胞毒性的保护作用；3.体外探讨自噬在H2S对高糖诱导的心肌细胞毒性的保护作用中的机制。研究方法1.细胞培养以AC16人心肌细胞系为研究对象,以5.5mmol/L的正常糖培养基作为正常对照(control),采用不同浓度的高糖(11mmol/L、22mmol/L、33mmol/L、44mmol/L)作为刺激体外模拟糖尿病状态,观察不同浓度高糖对心肌细胞活性的影响。2.体外分组干预分别观察经NaHS、Baf(自噬抑制剂)以及NaHS+Baf同时处理后对高糖诱导的心肌细胞活性的影响。细胞分组干预如下：Control组、HG组、HG+NaHS组、Control+ NaHS组、HG+ NaHS+B af组、control +Baf组。3.心肌细胞活力及损伤程度测定(1)采用Counting Kit-8 (CCK-8)法检测心肌细胞活力。计算不同刺激条件下心肌细胞存活率(细胞存活率是用存活细胞与对照组相比的百分比计算)。(2)用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测试剂盒检测不同刺激条件下细胞培养上清中LDH水平可评价细胞损伤和细胞毒性的程度。4.心肌细胞凋亡测定(1)用Hoechst 33258染色检测细胞凋亡,用荧光显微镜观察凋亡细胞的形态。(2)通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定Caspase-3活性。5. Western blot检测收集各组细胞并提取细胞蛋白,利用Western blot技术检测Bax、Bcl-2、LC3、 Beclin-1, p62和β-actin的蛋白表达水平。6.统计学分析数值变量资料数据以均数±标准差(Mean±SD)表示,多组间差异显著性比较应用One-Way ANOVA方差分析法,组间两两比较采用LSD,所有数据用SPSS17.0统计软件进行分析,以p<0.05为差异具有统计学意义。研究结果1.高糖刺激降低AC16心肌细胞活性CCK-8检测结果显示,与正常对照组相比,在经33mM和44mM的高浓度葡萄糖刺激24 h后AC16心肌细胞显著降低了细胞生存能力(p<0.05),而低浓度的葡萄糖(11 mM和22mM)刺激对细胞生存能力没有影响(p>0.05)。同时发现,与对照组相比,经22mM、33mM和44mM的高浓度葡萄糖刺激后,细胞培养上清液中的LDH水平显著增加(p<0.05)。2.高糖刺激可诱导AC16心肌细胞凋亡Hoechst 33258染色检测结果显示,与正常对照组和低浓度葡萄糖组相比,33mM和44mM的高糖刺激24小时后,AC16心肌细胞可明显地表现出核碎裂和核固缩现象。与此同时还发现,与对照组相比,高糖浓度在22、33和44mM时,可显著增加Caspase-3的活性(p<0.05)。此外,Western blot结果显示,在33和44mM高糖刺激AC16心肌细胞后,较对照组可显著上调Bax蛋白表达(p<0.01)和下调Bcl-2蛋白的表达(p<0.01)。3.高糖刺激抑制AC16心肌细胞自噬Western Blot检测结果显示,与正常对照组比较,高糖(22mM,33mM和44mM)刺激AC16心肌细胞24h后可成浓度依赖性降低Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达水平(p<0.05),而P62蛋白水平被明显上调(p<0.05)。上述差异在33mM和44mM的高糖组更加具有显著性(p<0.01)。4.硫氢化钠(NaHS)预处理可减轻高糖引起的心肌细胞损伤在用33mM的高糖刺激AC16心肌细胞24小时前,分别用2001μM和400μM的NaHS预处理30分钟,测定细胞存活和凋亡。CCK-8法检测结果表明,NaHS (200和400μM)预处理后明显减弱了HG诱导的细胞活力下降(p<0.05)。另外,Hoechst33258染色结果显示,NaHS预处理后较单纯HG组改善了AC16心肌细胞的核固缩和核碎裂现象。NaHS呈浓度依赖性的逆转了HG诱导的Caspase-3活性和Bax蛋白水平上调以及Bcl-2蛋白水平下调,上述结果在400μM的NaHS干预组较HG组均具有显著性差异(p<0.05)。5. NaHS可逆转高糖刺激对心肌细胞自噬的抑制作用Western Blot检测显示,HG (33 mM)诱导后下调的Beclin-1和]LC3-Ⅱ/Ⅰ水平在分别经200μM和400μM的NaHS预处理后被明显的逆转,其中NaHS(400μM)干预组较HG组具有显著性差异(p<0.05)。同时,NaHS还呈浓度依赖性的减少AC16心肌细胞中HG诱导的p62蛋白水平的增加,上述差异在NaHS (200μM)干预组(p<0.05)和NaHS (400μM)干预组(p<0.01)均具有显著性。6.抑制自噬减弱了NaHS对高糖诱导的心肌细胞毒性的保护作用为进一步评价自噬对于H2S在心肌细胞保护中的作用,AC16细胞在HG和NaHS处理的前提下同时予以自噬抑制剂Bafilomycin A1 (Baf)预处理30分钟。CCK-8检测结果显示,HG+ NaHS+Baf组较HG+NaHS相比,AC16心肌细胞的生存能力显著降低(p<0.05)；Hoechst 33258染色结果显示,NaHS预处理后挽救的HG刺激引起的细胞形态学改变被Baf干预后抵消。同时,HG+ NaHS+Baf组与HG+NaHS相比,Bax蛋白水平明显升高(p<0.05),Caspase-3活性显著升高(p<0.01),而Bcl-2蛋白水平显著下调(p<0.01),上述差异均具有显著性。研究结论1.高糖刺激可诱导AC16心肌细胞的损伤；2.心肌细胞自噬水平的降低与凋亡的增加参与了高糖诱导的心肌损伤；3.外源性H2S可减轻高糖引起的心肌细胞损伤,逆转抑制的心肌细胞自噬；4.自噬抑制剂Bafilomycin A1抵消了外源性H2S介导的HG刺激对心肌细胞损伤的保护作用。