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真菌在自然界中广泛存在,人类每天吸入成百上千的曲霉孢子,多数人可以检测到白色念珠菌的感染,同时其他的一些真菌物种也存在于我们的日常生活中,因此我们将接触数百种可能具有传染性的真菌物种。伴随着这些真菌的流行性特征以及它们的致病性发病率较低,很容易忽视真菌对公众健康的威胁。白色念珠菌对于健康人群来讲是一种很常见的共生菌,但是对于获得性免疫缺陷患者以及免疫力低下的病人来讲则是致死率很高的病原微生物。目前可用的真菌治疗手段虽然行之有效,但是往往伴随严重的毒副作用,同时抗真菌药物的耐药性也是一个严重的问题。因此迫切需要对机体抗真菌感染的免疫分子机制进行深入研究,这将有助于寻找新的药物靶点和设计抗真菌药物,制定行之有效的真菌感染性疾病的预防和治疗策略。目前为止,已经发现四个PRR家族能够识别真菌病原体并且诱导激活细胞内的一系列免疫反应,包括Toll样受体(TLR)、NOD样受体(NLR)、RIG-I样受体(RLR)和C-型凝集素受体(CLR),其中CLR启动固有免疫和适应性免疫反应在抵御真菌过程中发挥关键作用。一个典型的CLR是Dectin-1,Dectin-1结合配体后形成受体簇进而触发了 Dectin-1受体胞质结构域ITAM序列的磷酸化,导致磷酸酯酶SHP2招募酪氨酸激酶SYK,促使下游的关键激酶磷酸化激活,促进CARD9-BCL10-MALT1复合物的形成。CBM复合物的形成进一步启动信号级联反应,促使经典的核转录因子κB(NF-κB)途径和非经典的NF-κB途径的激活。其中在Dectin-1激活调控抗真菌固有免疫的过程会有很多关键分子发生酪氨酸的磷酸化修饰,包括SYK,SHP2,PLC-γ2,以及PKC-δ等,但是是否还存在其他能够调节Dectin-1通路信号激活的关键分子,值得我们进一步探究。首先我们明确细胞因子IL-4可以有效上调Dectin-1通路信号的激活,并且存在SYK依赖性和非依赖性的蛋白质酪氨酸磷酸化修饰。经过初步探索我们发现抑制剂NMS-873能够有效的抑制Dectin-1通路信号的激活,并且抑制抗真菌相关基因的表达。机制上来讲,NMS-873对于Dectin-1通路信号抑制可能是影响Dectin-1对SYK和SHP2的招募,进而抑制炎症性细胞因子和趋化因子的表达。研究目的:以信号通路的角度探索抗真菌天然免疫反应的具体机制,研究Dectin-1通路激活过程是否存在其他的能够调节Dectin-1通路信号的激活的关键分子。研究方法:1.明确细胞因子IL-4对Dectin-1通路信号的上调作用运用Western Blot(WB)检测IL-4对Dectin-1通路信号活化的影响,在WT细胞中使用特异性酪氨酸磷酸化抗体P-Tyr(4G10)检测不同时间点的酪氨酸磷酸化修饰条带的变化。2.研究SYK对Dectin-1通路信号活化的影响以及观察是否存在不依赖SYK的其他分子调控Dectin-1通路的活化运用WT和SYK缺陷小鼠体外诱导分化BMDMs和BMDCs检测激酶SYK对Dectin-1通路信号的活化的影响以及研究是否存在其他不依赖SYK的关键分子发生酪氨酸磷酸化修饰。3.探究坏死的关键分子RIPK3是否影响Dectin-1通路信号的活化WB 检测 WT 和 Ripk3-/-BMDMs 细胞中 Zymosan 诱导 Dectin-1 通路信号活化的差异,同时Real-time PCR检测dectin-1配体Zymosan诱导炎症因子和趋化因子表达的差异。4.研究NMS-873对Zymosan诱导Dectin-1通路信号活化的影响首先是探究不同浓度的抑制剂NMS-873和Celastrol对Dectin-1通路上游信号活化的影响,比较两者的效果差异。然后在WT BMDMs细胞中检测不同浓度NMS-873对Zymosan诱导通路信号活化的影响。Real Time PCR 检测 Zymosan 诱导的 Cxcl1、Il-1β和Il-6 表达的变化。ELISA检测Zymosan和Zymosan D诱导的Cxcl1、Il-1β和Il-6表达的变化。5.在Myd88缺陷细胞中研究NMS-873对Zymosan诱导Dectin-1通路信号的影响是否依赖于TLRsWT和Myd88缺陷小鼠分化的BMDMs中检测NMS-873对Zymosan诱导通路信号激活的影响,同时Real Time PCR检测Dectin-1配体Zymosan、Zymosan D、Curdlan 诱导的 Cxcl1、Il-1β和Il-6 表达的变化。6.研究NMS-873影响Dectin-1通路活化的潜在机制,是否通过影响SYK,SHP2招募于细胞膜从而抑制Dectin-1通路信号的活化运用差速离心的方法将破膜的细胞分为不同的组分,包括P1、P25、P100、S100组分,去除核组分P1然后在其他组分中检测NMS-873处理后对Dectin-1通路相关信号分子活化的影响。实验结果:1.IL-4上调Dectin-1信号通路2.脾脏酪氨酸激酶SYK调节Dectin-1通路信号的活化3.RIPK3不影响Dectin-1通路中CARD9上游信号的活化4.NMS-873抑制Zymosan诱导的Dectin-1通路信号的活化5.NMS-873抑制Dectin-1通路信号的活化并且不依赖TLRs通路6.NMS-873抑制P25,P100组分SYK和SHP2的磷酸化总结:我们发现了调节Dectin-1信号转导的小分子抑制剂NMS-873和Celastrol,并且NMS-873能够抑制抗真菌基因的表达,从机制上讲NMS-873有可能是影响Dectin-1对激酶SYK和磷脂酶SHP2的招募,进而影响其下游的信号转导过程,抑制抗真菌相关炎症因子和趋化因子的产生。