原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是一种慢性炎症性、进行性肝内胆汁淤积性自身免疫性病,以血清出现抗线粒体抗体(antimitochondrial antibody,AMA)、肝脏门脉周围淋巴细胞浸润、小胆管特异性破坏为特征,最终发展成肝硬化和肝衰竭。PBC在任何年龄段均可发病,主要累及中年妇女,它的发病高峰出现在50岁左右,25岁以下不常见。PBC典型病理表现为非化脓性损伤,胆管炎或肉芽肿性胆管炎,以破坏小胆管为主,镜下主要为中间胆管的慢性非化脓性破坏性变化,小叶间胆管减少。目前对PBC尚没有特效的治疗方法,熊脱氧胆酸(UDCA)被认为是目前治疗该病最有效的药物,虽然可以明显改善胆汁淤积症状,但却不能阻断疾病进程。PBC发展到晚期的唯一治疗选择是进行肝移植。PBC的确切发病机制至今尚不完全清楚,可能与遗传因素、病毒和细菌感染、自身免疫状态及环境因素等有关。很多研究认为本病的发病机理是机体对自身抗原的耐受性被打破,致使肝内中、小胆管上皮细胞不断受到免疫系统的攻击而引起胆汁淤积最终发病。但是,诱发自身免疫应答的始动因素和自身免疫耐受破坏的机制尚不清楚。研究表明PBC汇管区浸润的T细胞中,以CD4+T细胞居多,因此推断CD4+T细胞可能在免疫炎症中发挥重要作用。原位杂交分析发现PBC患者汇管区IFN-γ的表达明显增加,说明Thl细胞介导的免疫炎症在导致PBC肝脏病变过程中发挥重要作用。IL-27是2002年发现并命名的一种新的IL-6/IL-12家族细胞因子,主要作用于固有免疫系统和适应性免疫系统的各种细胞而发挥广泛的免疫调节作用。IL-27是由两条多肽链EBI3(与IL-12/p40亚基同源)和p28(与IL-12/p35亚基同源)通过二硫键组成的异二聚体。EBI3是一种可溶性细胞因子受体,最初在EB病毒转化的B细胞的培养上清中被发现。p28则是Pflanz等在基因库中找到的一种与IL-6/IL-12家族细胞因子同源的长链4螺旋多肽,p28不与EBI3结合时并无生物学活性,IL-27主要由活化的单核细胞、单核细胞来源的树突状细胞,淋巴细胞等产生。IL27的受体是由WSX-1和gp130共同组成。WSX-1和gp130两者单独均不能传递IL-27的信号,它们组成的复合物是介导IL227的生物学效应的必要受体形式,IL-27受体在T细胞和NK细胞的表达水平最高,其实是表达于表达于单核细胞,肥大细胞内皮细胞及郎罕氏细胞等。IL-27与受体的结合主要激活JAK/STAT信号转导途径。IL-27在CD4+和CD8+T细胞激活JAK1、JAK2、TYK2、STAT1-5。IL-27还可在B细胞激活STAT1,在单核细胞激活STAT1和STAT3,以及在肥大细胞激活STAT3。IL-27在各种细胞激活不同的JAK/STAT通路而引起的特异的生物学效应。很多文献表明,IL-27对Thl型免疫反应具有重要的调节作用。IL-27可以促进初始CD4+T细胞的增殖,也可以促进其向Thl细胞的分化及产生IFN-γ。而在高度Th1极化的情况下,IL-27的主要作用是限制Thl型免疫反应的强度和持续时间,从而保护机体免受过度的免疫反应的损伤。IL-27在抗感染免疫,抗肿瘤免疫及自身免疫性炎症等Th1型免疫主导的病理过程中起重要作用。基于以上国内外的研究现状和存在问题,本课题拟通过测定PBC患者IL-27信号通路表达变化,初步了解IL-27信号通路在PBC发病机制中的作用,从而为PBC的免疫学治疗提供一个新的靶点。第一部分IL-27介导的炎症反应在原发性胆汁性肝硬化中的作用原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种胆汁淤积性自身免疫性疾病,以血清中抗线粒体抗体阳性(AMA)和肝内小胆管进行性非化脓性损伤为特征。免疫组化结果表明PBC患者肝脏汇管区淋巴细胞浸润明显,这可能与PBC炎症有着密切的关系。其病因及发病机制目前仍不清楚。本部分探讨IL-27介导的免疫炎症性反应在PBC发病机制中的作用。我们使用荧光定量PCR,流式细胞术,酶联免疫吸附实验(ELISA),免疫组化等方法检测PBC患者IL-27的表达,生化常规测定PBC患者和健康对照者的谷草转氨酶(AST),碱性磷酸酶(ALP),谷丙转氨酶(ALT),总胆红素(TBIL)、谷氨酰基转移酶(GGT)水平,分析IL-27与它们之间的相关性。结果发现PBC患者外周血IL-27/P28亚基mRNA的表达显著高于CHB和HC组(P<0.05), IL-27/EBI3 mRNA未有明显改变；免疫组化结果显示IL-27在PBC患者肝脏呈阳性表达；流式细胞仪检测结果表明IL-27在PBC患者的CD4+T细胞表达率(72.4±6.22%)较慢性乙型肝炎组(59.4±7.03,P<0.01%)和健康对照组(1.7±0.55%,P<0.01)明显升高,而IL-27在各研究组的CD8+T细胞,单核细胞,B细胞中的表达无明显变化：PBC患者外周血血清IL-27的表达(126.25±36pg/ml)显著高于慢性乙型肝炎组(51.81±23.3pg/ml, P<0.01)和健康对照组(34.19±9.7pg/ml, P<0.01), PBC患者IL-27的血清蛋白表达水平与GGT(r=0.554,P<0.01)和TBIL(r=0.559,P<0.01)水平呈显著正相关,与ALT, AST和ALP无相关性。以上结果说明,PBC患者外周血和肝内汇管区均出现IL-27表达升高,且和一些肝功能指标呈正相关,说明可能通过一些信号通路促进CD4+T细胞向Thl细胞分化,最终参与肝内汇管区的炎症反应,使得IL-27在启动PBC发病早期的炎症反应过程中可能发挥重要作用。第二部分IL-27对PBC患者CD4+T细胞的作用机制我们前面的研究表明PBC患者的外周血以及肝脏中IL-27的表达发生变化,相关性分析初步说明IL-27的表达变化与PBC患者的肝功能呈正相关,但是IL-27是如何发挥作用的?作用在什么细胞上的?基于这些疑问,我们在本部分的研究分离PBC患者的CD4+T细胞,观察IL-27对PBC患者CD4+T细胞的分化、增值以及细胞因子分泌的影响,阐述IL-27通过CD4+T细胞在PBC发病机制中的作用。结果表明,IL-27可以诱导各研究组STAT1和STAT3酪氨酸磷酸化的表达,PBC患者组中最明显；IL-27还可以增强PBC患者组CD4+T细胞中T-bet的表达,抑制GATA3的表达；对细胞培养上清进行检测,IL-27可以增加PBC患者中CD4+T细胞培养上清中IL-2,γ-IFN的表达,抑制IL-10的表达。本部分研究说明IL-27可以促进PBC患者中CD4+T细胞向Thl分化,同时γ-IFN的表达增加更容易诱导Thl细胞的活化,使机体内免疫反应发生过度,导致了机体内免疫平衡的紊乱和免疫耐受的破坏,从而诱发了自身免疫性疾病。第三部分IL-27作用于PBC患者的单核细胞前面的研究表明PBC患者的外周血以及肝脏中IL-27的表达发生变化,且IL-27作用PBC患者CD4+T细胞后影响Thl的分化改变,在本部分的研究中,我们观察IL-27对PBC患者单核细胞的作用,进一步的阐述IL-27在PBC发病机制中的作用。结果表明,IL-27可以诱导各研究组STAT1和STAT3酪氨酸磷酸化的表达,PBC患者中最明显；相对于正常组,IL27能明显增加PBC患者单核细胞培养上清中IL-1(P<0.01)和TNF-α(P<0.01),而没有增加IL-8的表达(P>0.05)。综上所述,IL-27可以影响单核细胞培养上清炎性细胞因子IL-1和TNF-α的表达,PBC患者门管区淋巴出现淋巴细胞和单核细胞浸润,我们推测IL-27可能参与在PBC的发病过程,为今后进一步研究PBC的发病机制,提供思路。