研究目的及意义母体高温能显著增加人类和动物子代先天畸形的风险。在高温诱发的新生儿缺陷中,神经管畸形(neural tube defects,NTDs)发病率高且后果严重,是自然流产、死胎、死产和新生儿死亡的常见原因。NTDs不仅危及患儿的生命和健康,而且给社会和家庭造成沉重的经济负担。由于高温在自然环境中难以避免,多种疾病也常常伴有发热,孕妇很难避免受其影响,所以寻找有效的预防和治疗高温致畸的方法,对减少先天畸形的发生具有重要意义。研究发现,多种致畸因子均可通过引起神经上皮细胞过度凋亡而导致NTDs,如:糖尿病妊娠诱发的NTDs主要是由于高血糖引起细胞内氧化应激增多,导致神经上皮细胞过度凋亡所致。高温可抑制神经上皮细胞增殖,干扰上皮细胞的位置移动和形态变化,并使细胞凋亡增加,细胞数目减少,因而两侧神经褶不能正常闭合,导致神经管的形成和分化异常,从而形成NTD。因此,若能干扰神经上皮细胞的过度凋亡,就可能会减少NTDs的发生。牛磺酸是自然界中惟一以游离状态存在的氨基酸,广泛分布于动物组织细胞内,是中枢神经系统最丰富的游离氨基酸之一,其含量仅次于谷氨酸。牛磺酸与脑的发育关系密切,它能促进神经细胞的增殖、分化、成熟和存活,显著增加脑重量,在行为上具有提高学习与记忆能力的作用。在未成熟大脑,当细胞受到损伤时,其自身牛磺酸分泌会增加,以拮抗损伤所致的兴奋性毒性。外源性牛磺酸也能拮抗细胞损伤引起的兴奋性毒性,对神经细胞,尤其是发育时期的脑神经细胞具有重要保护作用。国内外研究结果均证实,牛磺酸在动物大脑生长发育中扮演神经营养因子和神经保护因子的作用,它还作为抗氧化剂和细胞调节因子参与保护神经细胞。另外,牛磺酸对多种细胞的钙离子平衡以及渗透压平衡的调节发挥重要作用。还有研究表明,牛磺酸能拮抗心肌细胞凋亡,促进早胚发育。但关于牛磺酸对高温后神经上皮细胞凋亡的保护作用,国内外尚未见报道。因此,我们提出牛磺酸对高温后的神经上皮细胞有保护作用的假说。本实验通过胎鼠神经管上皮细胞的原代培养,观察不同高温条件对神经上皮细胞增殖活性的影响,以及不同浓度牛磺酸溶液对高温后神经上皮细胞增殖、凋亡和分化的保护作用,并初步探讨其可能的作用机制,从而为有效预防和治疗高温致神经管畸形提供实验和理论依据。研究方法:1.观察高温对体外培养的神经上皮细胞凋亡的影响取孕12.5天小鼠,应用体视显微镜分离胚胎神经管,经机械吹打获取细胞悬液,接种于1%血清培养基。应用巢蛋白(Nestin)免疫荧光染色技术鉴定其是否为神经上皮细胞。将培养的神经上皮细胞分为正常对照组和39℃、40℃、41℃三个高温组,于高温后12h和24h,采用MTT法及DAPI染色法检测不同高温条件对上皮细胞增殖活性及凋亡的影响,以筛选高温致神经上皮细胞凋亡的最佳温度,用于本课题后续研究。2.观察牛磺酸对高温后神经上皮细胞增殖及凋亡的影响将培养的神经上皮细胞随机分为正常对照组,高温组及2 mM、6 mM、10 mM、15 mM和20 mM五个牛磺酸保护组,采用MTT法测定各组高温后12 h和24 h的细胞增殖活性,用DAPI染色法初步观察各组神经上皮细胞的凋亡状况。免疫荧光法测定各组细胞中Caspase-3的表达情况,以检测不同浓度的牛磺酸溶液对高温后神经上皮细胞增殖和凋亡的作用。3.观察牛磺酸对高温后神经上皮细胞分化的影响细胞接种培养24 h后,将培养液换为含10%胎牛血清的培养基,诱导神经上皮细胞分化,于高温后5天用免疫荧光法检测细胞中MAP-2和GFAP的表达情况,以观察牛磺酸对高温后神经上皮细胞分化的保护作用。结果:1.神经上皮细胞的形态学观察原代培养的神经上皮细胞胞体为圆形,细胞界线清楚,培养24 h后,细胞均已贴壁,多数呈椭圆形或多边形,胞体饱满,Nestin和DAPI双染色结果显示,95%以上的细胞呈Nestin强阳性着色,说明得到的细胞绝大多数为神经上皮细胞。2.高温对体外培养的神经上皮细胞增殖活性和凋亡的影响MTT法检测结果显示,高温可导致体外培养的神经上皮细胞增殖活性降低,且温度越高细胞活性越低。DAPI染色结果显示,高温可引起体外培养的神经上皮细胞发生凋亡,温度越高凋亡细胞越多。其中40℃培养细胞30 min引起的细胞活性和凋亡的变化最适宜于后续实验研究。3.牛磺酸对高温后神经上皮细胞增殖和凋亡的影响MTT法检测结果显示,在五个不同浓度的牛磺酸组中,只有6 mM和10 mM牛磺酸组的细胞增殖活性显著高于高温组。DAPI染色结果发现,高温组细胞凋亡率从高温后6 h开始显著升高,持续至48 h;而6 mM和10 mM牛磺酸组从高温后12 h开始明显抑制细胞凋亡,一直持续至48 h。Caspase-3染色结果显示,高温组Caspase-3阳性率从高温后6 h开始显著升高,持续至48 h;6 mM和10 mM牛磺酸组Caspase-3阳性率于高温后12 h开始明显低于高温组,一直持续至48 h。这一规律与DAPI检测到的细胞凋亡率的变化基本一致。4.牛磺酸对高温后神经上皮细胞分化的影响倒置相差显微镜下,正常对照组细胞数量多,呈神经元样或胶质细胞样形态,细胞有细长的突起且互相连接成网。高温组细胞数量少,突起短,网络稀疏。6 mM和10 mM牛磺酸保护组细胞数量较多,生长状态良好,细胞突起较高温组长。免疫荧光结果显示,正常对照组细胞MAP-2阳性率为37.74%;高温组MAP-2阳性率为29.68%,与正常对照组相比,差异有显著性(P＜0.01);6 mM和10 mM牛磺酸保护组细胞MAP-2阳性率分别为34.37%和34.90%,均明显高于高温组(P＜0.01),与正常对照组相比,无显著性差异。四组细胞的GFAP阳性率相比,差异无显著性。结论:分析实验结果,我们得出以下结论:1.高温可导致体外培养的神经上皮细胞活性降低,并促使神经上皮细胞凋亡。细胞子40℃条件下培养30 min是研究高温致神经上皮细胞凋亡的适宜条件。2.一定浓度范围(6 mM～10 mM)的牛磺酸溶液可明显增强高温后神经上皮细胞的增殖活性,并减少高温所致神经上皮细胞的过度凋亡。其对凋亡的抑制作用可能与降低细胞中Caspase-3的表达有关。3.一定浓度范围(6 mM～10 mM)的牛磺酸溶液可能对高温后神经上皮细胞分化为神经元有促进作用。综上所述,牛磺酸对体外高温引起的神经上皮细胞凋亡有一定的保护作用,并可能促进高温后神经上皮细胞的分化。