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尘螨(house dust mites)是一类普遍存在于人类居住环境中的螨类,与人类过敏性疾病有着直接关系,是引起过敏性疾病的主要过敏原。目前WHO过敏原命名组织已命名了37组尘螨过敏原组分。本课题组通过第四代nanopore测序技术对粉尘螨基因组和转录组进行测序,并发现了新过敏原Der f 23和Der f 39。Der f 23是粉尘螨的又一主要过敏原,和屋尘螨Der p 23一样具有较强的过敏原性。Der f 39是一种肌钙蛋白C同源物,肌钙蛋白C是钙调节骨骼和心肌收缩所必需的蛋白质,是最重要的过敏原家族之一。另外,研究还发现了烟曲霉中一种促进Th2反应的蛋白质,这种成份是RNase T2。其通过某种途径促进巨噬细胞M2极化和刺激调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)数量增加,从而促进Th2反应。目的:通过生物信息学方法分析,获取Der f 23并鉴定其过敏原性;比较Der f 23和Der p 23的过敏原性的差异;通过原核表达系统重组表达Der f 39并鉴定其过敏原性;通过原核表达系统重组表达烟曲霉RNase T2并复性;探究烟曲霉RNase T2对RAW264.7巨噬细胞以及Tregs的刺激情况,初步探究其致敏机制。方法:提取粉尘螨RNA,反转录为cDNA,构建表达载体;通过原核表达系统对Der f 23和Der f 39进行表达与纯化;通过ELISA、Western Blot、Dot Blot、氨基己糖苷酶释放实验、肺部病理组织切片观察等证明Der f 23的过敏原性;通过生物信息学分析与比较Der f 23和Der p 23序列,通过ELISA、Western Blot、Dot Blot等实验探究Der f 23和Der p 23的过敏原性的差异;通过ELISA、Western Blot、Dot Blot等实验证明Der f 39的过敏原性通过原核表达系统对烟曲霉RNase T2进行表达、纯化与复性;加入RNase T2查看其对RAW264.7巨噬细胞的刺激情况;体外加入RNase T2探究其对小鼠Tregs的刺激情况;用RNase T2免疫小鼠,探究其对小鼠Tregs的刺激情况。结果:第一部分:成功用原核表达系统对Der f 23进行克隆、表达、纯化,其中Der f 23大小约为26 kDa;证明了Der f 23在体内和体外都具有IgE结合活性,并将其于WHO/IUIS过敏原命名组织命名为粉尘螨主要过敏原;证明了Der f 23的P2区域能够影响Der f 23的IgE结合能力。成功用原核表达系统对Der f 39进行克隆、表达、纯化,大小约为18 kDa;证明了Der f 39都具有IgE结合活性,并将其于WHO/IUIS过敏原命名组织命名。第二部分:成功用原核表达系统对烟曲霉RNase T2进行克隆、表达、纯化;成功将RNase T2复性;证明了RNase T2对RAW264.7巨噬细胞有促进M2极化的作用;证明RNase T2在小鼠体内和体外都能刺激增加Tregs细胞。结论:Der f 23具有过敏原性,并获得了WHO/IUIS过敏原命名组织命名;Der f 23中P2区域能够减弱Der f 23的IgE结合能力;Der f 39具有过敏原性并获得了WHO/IUIS过敏原命名组织命名;RNase T2具有促进RAW264.7巨噬细胞向M2极化的作用;RNase T2具有刺激小鼠Tregs增加的作用。