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神经免疫异常是脑缺血再灌注损伤的重要机制之一。研究显示,小胶质细胞在脑缺血再灌注损伤后迅速激活,在不同的微环境条件下,小胶质细胞表现出加重神经元损伤（M1表型）或保护神经元（M2表型）的双重属性。因此调控小胶质细胞表型对于缺血性脑卒中的治疗显得尤为重要。我们前期工作显示ANXA1在小胶质细胞表型转化中起重要的作用。电针是祖国传统医学与现代医学相结合的治疗手段,电针治疗能明显改善脑缺血导致的神经功能缺损症状,促进脑卒中康复,临床广泛用于治疗脑卒中和疼痛相关疾病。ANXA1分子作为一个重要的抗炎分子是否介导了电针（Electroacupuncture,EA）的神经元保护作用?因此本研究在建立小鼠大脑中动脉缺血再灌注（Middle Cerebral Arteryocclusion/Reperfusion,MCAO/R）模型基础上,以电针为治疗手段,以ANXA1分子为干预靶点,探讨电针是否能通过ANXA1引起小胶质细胞表型转换对脑缺血神经元起保护作用。方法:选取健康成年的C57小鼠,建立MCAO/R模型,电针小鼠人中、承浆两穴;侧脑室注射Ad-shANXA1抑制ANXA1基因表达,侧脑室注射Boc-2以拮抗ANXA1受体FPR。采用脑片TTC染色、缺血后梗死体积、神经功能评分以及神经元蛋白表达检测方法明确电针脑保护的作用。通过水迷宫和旷场实验研究电针改善缺血损伤小鼠的学习和记忆功能的作用。免疫荧光双标对NeuN和IBA-1进行染色,观察神经元及小胶质细胞数量、活性、表型的改变。Western Blot和RT-PCR方法检测各组ANXA1、FPR、Arg-1、BDNF、IL-1β、TNF-α、iNos蛋白和基因表达。结果1.电针上调MCAO/R小鼠脑皮质区ANXA1及其受体FPR的表达将小鼠分为对照组（Sham）、模型组（MCAO/R）和模型+电针组（MCAO/R+EA）组,采用Western Blot和RT-PCR方法检测ANXA1及其受体FPR表达。结果显示:与Sham组相比,MCAO/R组中缺血损伤诱导ANXA1和FPR表达均上调,而电针干预后可进一步增强ANXA1和FPR的表达,与MCAO/R组相比有明显差异;其中蛋白表达与mRNA转录趋势有一致性。该结果提示ANXA1-FPR相关通路可能参与了电针对脑缺血的神经保护效应。2.电针通过ANXA1对MCAO/R小鼠发挥神经保护作用（1）侧脑室注射Ad-shANXA1抑制小鼠脑内ANXA1的表达小鼠分为对照组（Control）、乱序病毒组（SCR）和shANXA1组,通过免疫荧光和Western Blot结合的方法观察ANXA1的转染以及抑制效率。ANXA1免疫荧光结果显示:Control与SCR相比未见明显统计学差异,SCR与shANXA1相比,shANXA1组荧光强度明显降低。ANXA1蛋白表达结果显示:shANXA1组蛋白表达较SCR组明显降低。以上结果提示:侧脑室注射Ad-shANXA1可明显抑制小鼠脑内ANXA1的表达。（2）电针通过ANXA1改善MCAO/R小鼠神经缺损体征、缩小梗塞体积小鼠分组:Sham、MCAO/R、MCAO/R+EA、模型+电针+Boc-2组（MCAO/R+EA+Boc-2）和模型+电针+shANXA1（MCAO/R+EA+shANXA1）组,以Berdson评分对小鼠进行神经功能评分。结果发现:MCAO/R组神经功能缺损体征表现明显;与MCAO/R组相比,电针明显改善缺血再灌注引起的神经功能缺损体征;分别以Boc-2和shANXA1拮抗ANXA1受体FPR和抑制ANXA1表达,结果显示:电针改善缺血再灌注引起的神经功能缺损体征被Boc-2和shANXA1显著翻转,该结果提示,ANXA1介导了电针改善小鼠MCAO/R神经缺损体征。脑片TTC染色显示:电针处理后小鼠梗死区域明显缩小,较MCAO/R组相比梗塞灶减少约50%;与MCAO/R+EA组相比,MCAO/R+EA+Boc-2和MCAO/R+EA+shANXA1两组梗塞灶体积明显增加。表明电针缩小脑缺血后的梗塞灶体积的效果能被shANXA1或Boc-2抑制。（3）电针通过ANXA1增强缺血损伤小鼠学习和记忆能力在平台隐藏期,各组小鼠的逃避潜伏期和找到平台的距离均缩短,但电针干预组的小鼠表现出更强的学习记忆能力,电针的作用依赖于ANXA1,阻断ANXA1能翻转电针的作用。在Probe测试期,观察了小鼠在目标象限游泳的距离和时间、通过平台的次数以及寻找平台的潜伏期。结果显示:与Sham组相比,MCAO/R组小鼠寻找平台的潜伏期明显延长,而在目标象限游泳的距离、时间和通过平台的次数均显著减少;与MCAO/R组相比,经过电针治疗的小鼠寻找平台的潜伏期缩短,在目标象限游泳的距离、时间和通过平台的次数均有不同程度的延长;与MCAO/R+EA组相比,MCAO/R+EA+Boc-2和MCAO/R+EA+shANXA1两组对ANXA1予以拮抗可以削弱电针的作用,延长了小鼠找到平台的潜伏时间,减少了在目标象限游泳的距离、时间和通过平台的次数。结果提示:ANXA1介导电针改善缺血损伤小鼠的学习和记忆能力。（4）电针通过ANXA1改善MCAO/R小鼠抑郁状态并增强其探究欲望小鼠分为Sham、MCAO/R、MCAO/R+EA、MCAO/R+EA+Boc-2和MCAO/R+EA+shANXA1组,运用旷场实验观察10分钟之内小鼠总运动路程、总静止时间增多、进入中心区域停留的时间和进入中心区域的次数。结果如下:与对照组相比,MCAO/R组总静止时间增多,总运动路程、进入中心区域停留的时间和进入中心区域的次数减少,与MCAO/R组,电针干预组总静止时间减少,总运动路程、进入中心区域停留的时间和进入中心区域的次数明显增多,侧脑室注射Boc-2或shANXA1的小鼠再经过电针治疗,电针的效果不明显。以上该结果提示:缺血损伤后小鼠处于抑郁状态,探究欲望减弱,电针治疗可改善小鼠的抑郁状态,增强其探究欲望,并且电针的作用依赖于ANXA1,阻断ANXA1可以翻转电针的保护作用。（5）电针通过ANXA1减少脑缺血诱导的脑皮质区神经元丢失小鼠分为Sham、MCAO/R、MCAO/R+EA、MCAO/R+EA+Boc-2和MCAO/R+EA+shANXA1组,以Western Blot方法检测神经元特异性标记蛋白NeuN的表达水平。结果显示:电针能显著上调NeuN蛋白表达水平;与MCAO/R+EA组相比,注射Ad-shANXA1抑制ANXA1表达或FPR拮抗剂Boc-2后再行电针治疗,电针上调小鼠脑内NeuN阳性神经元数目的现象被翻转,伴随NeuN蛋白水平下调。结果提示:电针通过ANXA1实现对缺血再灌注损伤小鼠的神经保护作用。3.电针通过ANXA1诱导小胶质细胞表型由M1型向M2型转变（1）电针通过ANXA1对小胶质细胞活性以及神经元的影响小鼠分为Sham、MCAO/R、MCAO/R+EA、MCAO/R+EA+Boc-2和MCAO/R+EA+shANXA1组,采用免疫荧光双标法对神经元和小胶质细胞染色,观察小胶质细胞数量及形态的变化。对IBA-1标记的小胶质细胞计数统计发现:MCAO/R组较Sham组相比,活化的小胶质细胞数量显著增多;MCAO/R+EA组与MCAO/R相比,电针干预减少了激活的小胶质细胞数量;与MCAO/R+EA相比,侧脑室注射Boc-2和Ad-shANXA1后再行电针治疗的小鼠,小胶质细胞的活性仍然保持较高的水平。小胶质细胞形态观察显示:Sham组小胶质细胞为高度分枝状静息态,MCAO/R激活状态下的小胶质细胞胞体增大、突起变短或者消失,细胞形态呈阿米巴状,电针治疗能减少阿米巴样小胶质细胞的数量,电针的作用同样能被ANXA1阻断剂所抑制。提示电针通过ANXA1引起小胶质细胞活性改变,提高神经细胞对缺血缺氧的耐受能力。（2）电针通过ANXA1诱导小胶质细胞分泌表型由M1型向M2型转变小鼠分为Sham、MCAO/R、MCAO/R+EA、MCAO/R+EA+Boc-2和MCAO/R+EA+shANXA1组,采用Western Blot和RT-PCR方法检测小胶质细胞M1型代表分子（IL-1β、TNF-α和iNos）以及M2型代表分子（Arg1和BDNF）蛋白和mRNA表达。结果发现:电针能上调缺血损伤小鼠Arg1和BDNF的表达,同时下调IL-1β、TNF-α和iNos的表达,电针的抗炎作用同样能被shANXA1和FPR受体拮抗剂Boc-2翻转。结果提示:ANXA1-FPR通过调控小胶质细胞表型转变介导电针对缺血再灌注损伤小鼠的神经保护作用。将小鼠分为Control组和EA组,Western Blot方法检测了4种炎症因子BDNF、Arg1、TNF-α和IL-1β的蛋白表达,蛋白表达结果发现,与Control相比,EA组ANXA1及其受体FPR蛋白表达明显增高。IL-1β和TNF-α在电针后明显下调,Arg1和BDNF在电针后明显上调。以上结果提示:电针能调节正常状态下小鼠脑组织内ANXA1及神经炎症的表达。4.电针对MCAO/R小鼠外周血细胞ANXA1表达无影响将小鼠分为Control、MCAO/R、MCAO/R+EA和MCAO/R+EA+shANXA1组。Western Blot方法检测外周血细胞ANXA1蛋白表达,结果发现:Control与MCAO/R组相比,外周血细胞ANXA1蛋白表达未见明显差异;MCAO/R与MCAO/R+EA相比,ANXA1蛋白表达无明显统计学差异,MCAO/R+EA与MCAO/R+EA+shANXA1组相比,ANXA1蛋白表达未见上调或抑制。该结果提示:外周血细胞中的ANXA1未参与电针对脑组织中ANXA1的调节机制。结论:电针通过脑内ANXA1作用于FPR受体,改变小胶质细胞的形态和表型,促进抗炎型细胞因子的释放,提高神经元对缺血缺氧的耐受能力,从而保护受损的神经元。