研究背景抑郁症是一种影响患者思想、行为及躯体的常见精神情感类疾病,其主要症状包括快感缺乏、对事物失去兴趣、体重明显变化、睡眠障碍、精神运动性躁动或疲劳、自我认同感下降、自杀意念等。《精神疾病诊断和统计手册》（DSM-V）指出一个人至少两周出现上述症状即可诊断为抑郁症。抑郁症影响了全球约3.5亿人,与其相关的发病率和死亡率使抑郁症成为全球第一大致残诱因,抑郁症的总体负担居所有疾病之首。中医古籍中并未提及“抑郁症”的病名,但因与中医学的“郁证”有相似情志不畅的症状,故将其归属于广义“郁证”的范畴;从西医发病机制来看,抑郁症具有异质性,潜在的遗传、代谢、内分泌和神经生物学因素均可导致抑郁。长期压力可引起情感、认知及其他生物反应从而导致抑郁症,而免疫系统在此过程中发挥着重要作用。目前抑郁症的治疗主要是单胺类抗抑郁药,但多达30%的抑郁症患者对此类抗抑郁药无反应,约40%的患者在中断治疗后有残留症状。一项荟萃分析证明,给予抑郁症患者塞来昔布等抗炎药作为补充疗法,可增强抗抑郁药疗效,且不会增加不良反应的风险,综上,抗炎治疗是更有前途的辅助抗抑郁策略。2005年,美国食品药品管理局（Food and Drug Administration,FDA）已批准迷走神经刺激（Vagus Nerve Stimulation,VNS）治疗难治性抑郁症,VNS可改善药物抵抗性抑郁症患者的情绪低落状态,并可抑制中枢促炎细胞因子的产生,减轻脑部炎症,但VNS存在易感染、呼吸困难、喉咙疼痛等手术并发症。神经解剖学表明,耳甲区是体表唯一有迷走神经传入纤维分布的区域,而此区域恰好有心、肝、脾等耳穴分布,因此一种基于VNS技术和中医耳穴理论的经皮耳甲迷走神经刺激（Transcutaneous Auricular Vagus Nerve Stimulation,taVNS）疗法应运而生。有证据表明,taVNS显著降低了轻中度抑郁症患者的汉密尔顿抑郁量表和自评抑郁量表得分,产生与VNS相似的临床疗效,且taVNS的抗抑郁效应能在治疗结束后维持三个月,是一种安全有效的新方法。刺激迷走神经可产生全身抗炎作用,这可能是taVNS对抑郁症起效的重要原因,然而,taVNS通过抗炎以产生抗抑郁作用的中枢分子生物学机制尚未明确。由于迷走神经抗炎信号是由α7烟碱乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptors,α7nAchR）介导,海马是调控情绪的重要脑区,中枢的α7nAchR主要分布在海马小胶质细胞上,故本实验采用α7nAchR（-/-）基因敲除模式大鼠,探讨taVNS 对慢性不可预知性温和应激（Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS）模型大鼠海马α7nAchR、核转录因子（Nucleus Factor-κB,NF-κB）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）等相关神经炎症标志物的影响,进一步阐释taVNS通过抗炎以抗抑郁的中枢效应机制。目的（1）观察taVNS对CUMS模型大鼠行为学的影响;（2）观察taVNS对CUMS模型大鼠血浆、海马炎症细胞因子的影响;（3）采用α7nAchR（-/-）基因敲除模式大鼠,比较taVNS对CUMS模型大鼠海马α7nAchR、NF-κBp65、p-NF-κB p65、IL-1β等相关神经炎症标志物的表达,观察α7nAchR在抗抑郁中的作用,进一步阐释taVNS中枢抗炎以抗抑郁的作用机制。方法30只SPF级健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠,体质量为200±20g;3只SPF级雄性成年F1代杂合子α7nAchR（-/+）基因敲除大鼠,体质量为200±20g,将其与野生型雌鼠合笼、繁殖两代,经鼠尾DNA提取、PCR鉴定后得到10只雄性纯合子α7nAchR（-/-）基因敲除模式大鼠。适应性喂养一周后,将SD大鼠随机分为空白组、模型组、taVNS组,每组10只,除空白组外,模型组、taVNS组、α7nAchR（-/-）+taVNS组大鼠采用孤养结合CUMS造模方法制备抑郁模型,造模时间为42天,具体7种慢性应激方法包括:冰水游泳（4℃,5min）、昼夜颠倒（12/12h）、潮湿垫料（24h）、禁食（24h）、禁水（24h）、夹尾（3min）、电击足底（30V,1min）,每天随机选取一种应激刺激方法,且每种刺激不能连续两天出现。在造模第21天,以糖水偏好实验、旷场实验、强迫游泳实验观察CUMS模型大鼠是否造模成功;造模成功后,对taVNS组和α7nAchR（-/-）+taVNS组大鼠连续干预21天:在2%异氟烷吸入麻醉下,采用韩氏电针仪,连接两个正负极自吸附导电磁铁,无创固定于大鼠耳甲两侧,电刺激部位为耳甲区,频率为疏密波2/15 Hz,强度为2mA,每次30min,每天1次;空白组和模型组不予taVNS干预。分别在造模前（-21d）、成模后（0d）、干预后（21d）各测量一次大鼠体质量、糖水偏好百分比、旷场实验水平和垂直运动得分、强迫游泳静止不动时间;实验结束后,腹主动脉取血,应用Bio-Plex悬液芯片技术检测各组大鼠血浆促炎细胞因子TNF-α IL-1β、IL-6、IL-18及抗炎细胞因子IL-4、IL-10含量的变化;采用Western Blot检测α7nAchR、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IL-1β蛋白在海马中的表达量;应用免疫荧光观察海马α7nAchR、IL-1β、小胶质细胞的表达及形态变化。结果（1）体质量:造模前（-21d）各组大鼠体质量无统计学差异（P>0.05）,组间具有可比性;成模后（0d）,与空白组比较,模型组、taVNS组、α7nAchR（-/-）+taVNS组大鼠体质量明显降低（P<0.01或P<0.001）;taVNS干预第21天（21d）,与模型组相比,taVNS组大鼠体质量明显增加（P<0.001）;与taVNS组比较,α7nAchR（-/-）+taVNS组大鼠体质量降低（P<0.001）。（2）糖水偏好实验:造模前（-21d）各组大鼠糖水偏好百分比无统计学差异（P>0.05）,组间具有可比性;成模后（0d）,与空白组比较,模型组、taVNS组、α7nAchR（-/-）+taVNS组大鼠糖水偏好百分比明显降低（P<0.001）,三组大鼠表现出明显的抑郁样行为;taVNS干预第21天（21d）,与模型组相比,taVNS组大鼠糖水偏好百分比明显增加（P<0.001）;与taVNS组比较,α7nAchR（-/-）+taVNS组大鼠糖水偏好百分比降低（P<0.001）。（3）旷场实验:造模前（-21d）各组大鼠旷场实验水平运动得分和垂直运动得分无统计学差异（P>0.05）,组间具有可比性;成模后（0d）,与空白组比较,模型组、taVNS组、α7nAchR（-/-）+taVNS组大鼠旷场实验水平运动得分和垂直运动得分明显降低（P<0.001）,此实验表明三组大鼠探索能力降低,出现焦虑抑郁样行为;taVNS干预第21天（21d）,与模型组相比,taVNS组大鼠水平、垂直运动得分明显增加（P<0.01或P<0.001）;与taVNS组比较,α7nAchR（-/-）+taVNS组大鼠水平运动得分减少（P<0.05）。（4）强迫游泳实验:造模前（-21d）各组大鼠在强迫游泳实验中静止不动时间无统计学差异（P>0.05）,组间具有可比性;成模后（0d）,与空白组比较,模型组、taVNS组、α7nAchR（-/-）+taVNS组大鼠强迫游泳静止不动时间明显增加（P<0.001）,此实验表明三组大鼠出现抑郁样行为;taVNS干预第21天（21d）,与模型组相比,taVNS组强迫游泳静止不动时间减少（P<0.01）;与taVNS组比较,α7nAchR（-/-）+taVNS组大鼠静止不动时间有上升趋势,但无统计学差异（P>0.05）。（5）血浆 TNF-α、IL-1β、IL-18、IL-6、IL-4、IL-10 含量:实验结束后（21d）,大鼠腹主动脉取血,应用Bio-Plex悬液芯片技术检测各组大鼠血浆炎症细胞因子含量变化。与空白组比较,模型组大鼠血浆TNF-α、IL-1β、IL-18含量增加（P<0.05或P<0.01）,血浆IL-4、IL-10含量显著降低（P<0.001）;与模型组相比,taVNS组大鼠血浆TNF-α、IL-1β、IL-18含量减少（P<0.05或P<0.01）,IL-6有降低趋势,但无统计学意义（P>0.05）,血浆IL-4含量增加（P<0.01）,血浆IL-10含量有升高趋势,但无统计学差异（P>0.05）;与taVNS组比较,α7nAchR（-/-）+taVNS组血浆TNF-α含量升高（P<0.05）,IL-1β、IL-18、IL-6含量有增加趋势,但无统计学意义（P>0.05）,血浆IL-4含量有下降趋势,但无统计学差异（P>0.05）。（6）海马α7nAchR、IL-1β、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白表达:①Western Blot:实验结束后（21d）,断头取脑,用Western Blot方法检测各组大鼠海马α7nAchR、IL-1β、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表达。结果显示,与空白组比较,模型组大鼠海马α7nAchR 表达降低（P<0.05）,IL-1β、NF-κB p65、p-NF-κB p65 表达明显增加（P<0.001）;与模型组相比,taVNS组α7nAchR表达明显增加（P<0.01）,IL-1β、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白表达显著降低（P<0.01 或P<0.001）;与 taVNS组比较,α7nAchR（-/-）+taVNS 组大鼠 IL-1β、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白表达增加（P<0.05 或 P<0.01）,因α7nAchR（-/-）敲除,故α7nAchR（-/-）+taVNS 组大鼠海马α7nAchR蛋白无表达。②免疫荧光:实验结束后（21d）,灌流、取脑、切片,应用免疫荧光技术观察各组大鼠海马α7nAchR、IL-1β、小胶质细胞的表达。本实验采用Iba-1染色以观察各组大鼠海马小胶质细胞的形态,判断其静息或活化状态。IL-1β/Iba-1/DAPI结果显示,空白组小胶质细胞表达较少且呈静息态;与空白组相比,模型组小胶质细胞表达增多且活化,促炎因子IL-1β数目明显增加;与模型组比较,taVNS组小胶质细胞表达减少,静息态小胶质细胞的比例增多,其形态自由且舒展,IL-1β数目减少;与taVNS组相比,α7nAchR（-/-）+taVNS组小胶质细胞表达增加,其形态表现为胞体较大、突起较短粗的阿米巴样激活状,IL-1β数目增加。α7nAchR/Iba-1/DAPI结果显示,小胶质细胞形态变化同上。与空白组相比,模型组α7nAchR表达减少;与模型组比较,taVNS组α7nAchR表达增加;因α7nAchR（-/-）敲除,故α7nAchR（-/-）+taVNS组大鼠海马α7nAchR蛋白无表达。结论（1）21天CUMS造模可使大鼠出现明显的抑郁样行为,表现为糖水偏好百分比、旷场实验水平和垂直运动得分降低,强迫游泳静止不动时间延长,21天taVNS干预可显著改善CUMS模型大鼠的上述行为;（2）taVNS干预后,CUMS模型大鼠血浆促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-18的含量降低,抗炎细胞因子IL-4、IL-10的含量升高,海马IL-1β蛋白表达降低,说明taVNS缓解了 CUMS模型大鼠的外周和中枢炎性反应,具有一定的全身抗炎作用;（3）taVNS上调了 CUMS模型大鼠海马α7nAchR的表达,下调了 NF-κB p65及其磷酸化的表达,继而减少了 IL-1β的产生与释放,而对α7nAchR（-/-）基因敲除模式大鼠的上述神经炎症标志物无明显作用,说明taVNS抗抑郁效应与α7nAchR密切相关,海马α7nAchR/NF-κB信号通路是taVNS发挥中枢抗炎以抗抑郁的作用机制之一。