喹乙醇(OLA)具有良好抗菌促生长效果,在我国养猪业中广泛使用。然而毒理学研究证实,OLA及其代谢物具有光敏毒性、肾毒性、遗传毒性、可能的致突变性和致癌性。它们在动物性食品中的残留可能引发一系列食品安全问题,同时对养猪业的健康发展也能造成不利的影响。为了控制OLA的残留,我国农业部规定其只能用于35 kg以下的仔猪,3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)是它的残留标志物,其在肝脏和肌肉中的最大残留限量(MRL)分别为50μg/kg和4μg/kg,休药期(WDT)为35 d。MRL和WDT的制定为OLA的合理使用提供了指导。但是在实际生产中,OLA的标签外用现象时有发生。单独依靠MRL和WDT很难有效地避免它在动物性食品中的残留。通过实样抽检的方式实施监控又可能造成大量不必要的浪费。生理药动学模型(PBPK)作为一种科学的残留预测方法,可以弥补现有残留监控体系的不足。它在OLA残留监控中的应用能够有效地保障动物性食品的安全。但是,代谢物残留预测的问题和预测结果的不确定性都使得现有的PBPK模型尚不能满足OLA残留监控的需要。因此,本研究开展了OLA在猪体内的PBPK研究,并通过外推的方式初步建立了同类药物喹烯酮(QCT)和喹赛多(CYA)残留预测的PBPK模型。通过这些研究,完善了喹嗯啉类三种饲料添加剂的残留监控体系,基本解决了PBPK模型代谢物残留预测和预测结果不确定性的问题。1.定量分析方法的建立以本实验室前期研究为基础,建立了检测猪可食性组织和体液中MQCA的高效液相色谱(HPLC)法。其中,肌肉、肝脏和肾脏的样品处理在已有方法的基础上结合本研究的需要稍作调整；脂肪样品先用磷酸盐缓冲液萃取,然后以混合模式的弱阴离子固相萃取小柱(Oasis MAX)净化；尿液样品先用酸化的乙酸乙酯提取,然后以薄层色谱法净化；酸化的血浆样品以乙酸乙酯提取后直接检测。结果表明,该方法检测猪肌肉、脂肪和血浆中MQCA的最低定量限(LOQ)为4μg/kg,猪肝脏为10μg/kg,猪肾脏为20μg/kg,猪尿液为100μg/kg。组织样品和体液样品中分别添加LOQ浓度、2倍LOQ浓度和4倍LOQ浓度的MQCA,其绝对回收率为70%～120%,相对标准差均小于15%。可食性组织和体液样品的工作曲线线性范围为4μg/kg～640μg/kg,相关系数均大于0.96。该方法的灵敏性、准确度和精密度符合定量分析方法的要求,能够满足PBPK研究的需要。2.喹乙醇在猪体内生理药动学模型的研究通过平衡透析法测定了MQCA的血浆蛋白结合率。准确吸取猪血浆2 mL,加入到处理好的透析袋中。于12支50 mL塑料离心管(9支用于血浆蛋白结合率测定,3支不加血浆用作试剂对照)中加入0.01 M磷酸盐缓冲液(pH=7.4)10 mL,然后再加入不同浓度的MQCA使其终浓度分别为50μg/L、200μg/L、800μg/L。将透析袋置于离心管中,保持袋内液面高度与袋外一致,于4℃下透析。分别于12 h、24h、48 h和96 h取袋外缓冲液150μL,用HPLC法测定其中MQCA的浓度。血浆蛋白结合率为结合药物的量和添加药物总量的商。结果表明,透析袋内外的MQCA浓度在96 h后基本达到平衡,由此测得的血浆蛋白结合率(3个添加浓度的平均值,n=9)为27.99%。通过在体试验测定了MQCA在猪体内的肾清除率。以4头体重为40±5.82 kg的杜长大三元杂交猪为试验动物。给药前从前腔静脉采集空白血浆10 mL,然后耳静脉单剂量推注MQCA注射液5 mL(约含MQCA 20 mg),再将它们置于自制代谢笼中饲养,于给药后第5 h采集血样约10 mL,同时收集从给药到试验结束10 h内的尿液并测量体积。体液样品中的MQCA采用已建立的HPLC法测定。肾清除率为尿液中MQCA的排出速率与集尿中点血浆中MQCA浓度的商。经过计算,MQCA在4头猪中的肾清除率在0.051 L/(h*kg)～0.111 L/(h*kg)之间,其均值为0.094L/(h*kg)。通过稳态给药法测定了MQCA在猪体内的组织／血浆分配系数。以4头体重为20±3.98kg的杜长大三元杂交猪作为试验动物。先确定MQCA在体内分布达到稳态所需的时间。将一头猪保定于自制保定架上,以2 mL/min的速度从耳静脉输注MQCA静脉输注液。于开始给药后的5 min、15 min、30 min、60 min、90 min和120min从前腔静脉采血,按已建立的HPLC法测定血中MQCA的浓度,绘制药-时曲线。确定MQCA在猪体内达到稳态分布所需的时间后,按同样的方法给药。达到稳态后,剖杀全部试验猪,取肝脏、肾脏、脂肪、肌肉和血样,按照确定的HPLC法测定。肌肉、脂肪和肝脏中的组织/血浆分配系数等于稳态组织浓度除以稳态血浆浓度。肾脏/血浆分配系数的计算需在此基础上除以1减去MQCA在肾脏中的器官提取率(1-E)。结果表明,MQCA在猪体内分布达到稳态所需时间为60 min～120 min,肝脏/血浆分配系数(均值,n=4)为1.02,肾脏/血浆分配系数(均值,n=4)为4.02,肌肉/血浆分配系数(均值,n=4)为0.23,脂肪/血浆分配系数(均值,n=4)为0.39。通过OLA在猪体内的残留消除研究测定了MQCA在猪肝脏、肾脏、脂肪、肌肉和血浆中的残留消除数据。37头健康的杜长大三元杂交猪(体重为18.084±1.64kg)被随机分为空白组(5头)和试验组(32头)。试验组又进一步分为两组,一组(20头)用于提供模型拟合所需数据,另一组(12头)用于模型的验证。空白组(5头)在整个试验期间每天饲喂空白饲料；试验组(32头)于第1～30 d饲喂含有OLA的预混料,在第31 d改喂空白饲料,一直持续到试验结束。于停药后第0 d(12 h)、3 d、10 d、17 d、和28 d,分别从空白组和试验组随机选取1头和4头猪剖杀；于停药后第7 d、21d和23 d从试验组取4头剖杀。收集足量的肝脏、肾脏、脂肪、肌肉和血液样品,用已建立的HPLC法测定其中MQCA的浓度。结果表明,休药后不同时间,MQCA在猪体内的残留水平依次是肝脏>肾脏>血浆>脂肪>肌肉；休药后28 d,除肾脏、血浆和肌肉外,其他样品中均能检测到高于方法LOQ的浓度。在上述工作的基础上,建立了预测OLA代谢物MQCA在猪体内残留消除的PBPK模型。在该模型中,OLA口服吸收的速度和程度通过胃排空率和吸收速率常数来描述；OLA到MQCA的代谢通过“一步代谢”的假设和一级动力学方程进行简化；OLA在猪体内代谢的主要部位被假设为肝脏、胃肠道和肾脏；生理参数、其他化合物特异性参数、喹乙醇的药动学数据和组织残留数据则直接地或者利用UN-SCAN-IT (version 5.1.6)和WinNonlin (version 5.1.2)软件从相关文献中收集得到；质量平衡方程的求解由专业模拟软件ACSL xtreme (version 1.4, Aegis Technologies Group Inc, Huntsville, Ala)完成；同时,还采取了有针对性的参数调试和“逐步拟合”的参数评估策略对模型参数进行了拟合。结果表明,以肝脏为代谢部位建立的PBPK模型最能合理地反应OLA和MQCA在猪体内的处置,尽管该模型低估了血浆中OLA的水平以及休药后12 h各房室中MQCA的浓度,但很好地预测了休药后3 d～36 d可食性组织中MQCA的残留消除。采用中心差分公式计算了所有参数的灵敏系数,并将经过标准化后的灵敏系数用于判断该参数的灵敏性。结果表明,尽管在不同的模型结构中参数的灵敏性存在巨大的差异,但与化合物体内处置密切相关的组织／血浆分配系数、清除率和代谢速率常数在每个模型中均为敏感性参数。以蒙特卡罗随机抽样的方法评估了肝脏模型、胃肠道模型和肾脏模型预测结果的不确定性。心输出率和组织／血浆分配系数是不确定性分析的目标参数,它们的变异性以对数正态分布进行描述。两参数在99%的置信区间内随机取值并代入模型运算1000次后的结果表明,肝脏模型和胃肠道模型预测结果的可能范围包含了几乎所有的实测数据,而肾脏模型则出现较大的偏差。3.生理药动学模型外推的研究以OLA的胃肠道模型为基础,通过外推得到了同类化合物QCT和CYA的PBPK模型。在外推的过程中,QCT和CYA原形的药动学参数从文献收集,喹噁啉-2-羧酸(QCA)的化合物特异性参数参考OLA模型中MQCA的拟合结果,QCA和MQCA代谢生成速率常数根据尿-药数据和组织残留数据进行拟合得到。结果表明：QCT外推模型高估了休药后0 d肾脏和脂肪中MQCA的残留水平,但在残留消除后期获得了很好的预测效果；对肌肉和肝脏,该模型预测结果与实测数据在休药后0 d～15d取得了很好的一致性；CYA外推模型显著地高估了休药初期肝脏、肾脏、肌肉和脂肪中QCA的水平,但准确地预测了休药后7 d～21 d可食性组织中QCA的残留消除。综上所述,本研究首次建立了能够预测不同暴露情况下OLA残留标志物MQCA在猪可食性组织中残留消除的PBPK模型,并通过化合物间外推的方式初步建立了QCT和CYA残留预测的PBPK模型。研究结果有助于完善喹嗯啉类3种饲料添加剂的残留监控体系,对保障动物性食品的安全和养猪业的健康发展有十分重要的意义；同时,本研究也基本解决了现有PBPK模型无法预测代谢物残留和预测结果存在不确定性的问题,为扩大PBPK模型在食品安全领域的应用奠定了基础。